“即刻法”卡马西平治疗药物监测的室内质量控制及药学实践

吴妍，李会婷，张哲弢，史天陆

[中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)药剂科，合肥 230001]

1 材料

1.1仪器 LC-2010A HT岛津高效液相色谱仪(紫外检测器，四元低压泵，自动进样器，LabSolutions Version 5.51色谱工作站)；TGL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；L2-6K台式低速离心机(湖南可成仪器设备有限公司)；FA2004B电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司，感量：0.000 1 g)；XH-C涡旋混合器(金坛区白塔新宝仪器厂)；氮吹仪(上海皓庄仪器有限公司，型号：PBC-B2)；移液器(规格：10，100及1000 μL，DRAGONLAB)。

1.2试剂 CBZ对照品(CAS#：100142-201105，批号：8RBB-6M7R，规格：100 mg，含量：99.7%)、奥硝唑对照品(ID：4QRY-WNB1，批号：100608-201102，规格：100 mg，含量：99.8%)以上均由中国食品药品检定研究院提供；三乙胺(批号：20130918，规格：500 mL，纯度：分析纯)、二氯甲烷(批号：20160822，规格：500 mL，纯度：分析纯)，以上均由国药集团化学试剂有限公司提供；磷酸二氢钾(批号：180515，规格：500 g，纯度：分析纯，无锡市展望化工试剂有限公司)；灭菌注射用水(批号：2004213201，规格：500 mL，石家庄四药有限公司)；色谱甲醇(批号：180702，规格：500 mL，纯度：色谱纯，西陇科学股份有限公司)；医用高纯度氮气(N2)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 参考相关文献[11]，并结合实验室工作实际，最终确定如下色谱条件，色谱柱：依利特Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇：0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液=40：60，柱温：30 ℃，检测波长：210 nm，流速：1.0 mL·min-1，进样量：20 μL。

2.2CBZ、奥硝唑工作液配制 精密称取CBZ对照品5.0 mg至1.5 mL一次性离心管中，加1 mL色谱甲醇溶解得5 mg·mL-1CBZ储备液。取适量色谱甲醇，依次将储备液稀释为5，10，20，40，80，100及160 μg·mL-1的系列浓度 CBZ工作液，储存于-20 ℃冰箱备用。 另外精密称取奥硝唑对照品5.0 mg至1.5 mL一次性离心管中，加1 mL色谱甲醇溶解得5 mg·mL-1奥硝唑储备液。取适量色谱甲醇，将储备液稀释为1 mg·mL-1奥硝唑工作液，储存于-20 ℃冰箱备用。

2.3自制CBZ血浆质控品 取健康人血浆90 μL，分别加入5，10，20，40，80，100及160 μg·mL-1的CBZ工作液10 μL，得新鲜配制的自制CBZ血浆质控品，浓度分别为0.5，1，2，4，8，10及16 μg·mL-1。

2.4即刻法室内质量控制

2.4.1标准曲线 取“2.3”项下系列浓度质控品分别加奥硝唑工作液5 μL，振荡30 s后加二氯甲烷1 mL，涡旋操作3 min，剧烈振荡约200次，5000 r·min-1离心5 min(r=6 cm)，取下层澄清液于另一一次性离心管，50 ℃氮气(N2)吹干，经甲醇100 μL溶解残渣，涡旋1 min，10 000 r·min-1离心5 min(r=6 cm)，取上清液60 μL，按“2.1”项色谱条件进样分析，记录峰面积。待测质控品标示浓度(X， μg·mL-1)作为横坐标，CBZ与内标峰面积比值(Y)作为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程Y=0.077 7X-0.002 1(r=0.999 4)。该结果表明，CBZ血药浓度检测线性范围为0.5～16 μg·mL-1。典型色谱图见图1。

1.奥硝唑；2.卡马西平。图1 CBZ质控品HPLC色谱图1.ornidazole；2.carbamazepine.Fig.1 HPLC chromatogram of carbamazepine quality control product

2.4.2精密度及提取回收率试验 取新鲜配制高(10 μg·mL-1)、中(4 μg·mL-1)及低(1 μg·mL-1)浓度自制CBZ质控品，经“2.4.1”项方法进行血样预处理后，吸取上清液60 μL，按“2.1”项色谱条件进样分析。重复该步骤平行操作6次，计算得高、中及低浓度CBZ质控品日内精密度相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)分别为2.47%，3.21%，6.34%。连续操作3 d，计算得日间精密度RSD分别为2.07%，5.35%，7.55%。与此同时，配制对应高、中及低浓度不含生物基质的CBZ对照品溶液(甲醇溶解)，按“2.1”项色谱条件进样。将质控品测得的信号强度与相同浓度标准溶液所测得的信号强度进行比较。每天平行操作6次，计算得CBZ高、中及低浓度质控品日内提取回收率分别为(72.18±3.01)%，(75.58±4.98)%及(65.15±2.18)%。连续操作3 d，计算得日间提取回收率分别为(73.73±7.24)%，(75.69±3.36)%及(69.76±5.17)%。具体见表1。试验结果符合2015年版《中华人民共和国药典》(四部)要求[12]。

表1 CBZ质控品血药浓度监测的精密度及提取回收率 Tab.1 Precision and extraction recovery rate of carbamazepine quality control produt's concentration

表2 即刻法SI界值Tab.2 Seperation index community of instant method

表3 CBZ治疗药物监测的即刻法室内质控数据 Tab.3 Internal quality control data of instant method for therapeutic drug monitoring of carbamazepine

图2 CBZ治疗药物监测的室内质控图Fig.2 Internal quality control chart for therapeutic drug monitoring of carbamazepine

2.5CBZ治疗药物监测的药学实践

2.5.1患者基本信息 患者，男，70岁。2019年5月15日因“发作性四肢抽搐2 h”就诊我院神经内科，入院诊断为“症状性癫痫、多发性脑梗死、高血压病3期、2型糖尿病”。

2.5.2诊疗过程 2019年5月15日医嘱给予CBZ 0.2 g，bid，长期抗癫痫治疗，住院期间癫痫未再发作；2019年5月21日监测CBZ稳态谷浓度5.05 μg·mL-1(随行质控品实测值为3.64 μg·mL-1，该点为即刻法室内质控的第一个点，即N=1)，症状好转后出院。

2019年12月31患者因“发作性四肢抽搐4 h”再次入院，家属代诉出院后遵医嘱长期规律服用CBZ 0.2 g，bid，次日早晨监测卡马西平稳态谷浓度为6.22 μg·mL-1(随行质控品实测值为3.39 μg·mL-1，N=8，N2s=2.03，计算即刻法SI上限=1.13，SI下限=1.48)，临床医师考虑CBZ单药抗癫痫效果不佳，2020年1月1日医嘱卡马西平0.2 g，bid，联合拉莫三嗪25 mg，bid，抗癫痫，症状好转后出院。

2020年4月5日患者再次因“发作性四肢抽搐4 d”入院，家属代诉出院后遵医嘱长期规律服用CBZ 0.2 g，bid，联合拉莫三嗪25 mg，bid。病程中患者癫痫反复发作，尚有胡言乱语、精神障碍，高级皮层功能障碍，且有发热。考虑病情较重，立即完善头颅磁共振、脑脊液检查，排除中枢神经系统感染可能，予以苯巴比妥 0.1g，im，q8h控制癫痫症状；2020年4月6日早晨监测CBZ 稳态谷浓度4.79 μg·mL-1(随行质控品实测值为3.5 μg·mL-1，N=9，N2s=2.11，计算即刻法SI上限=1.38，SI下限=1.57)；2020年4月7日予以调整口服抗癫痫药物方案为CBZ 0.2 g，tid，联合拉莫三嗪100 mg，qd；2020年4月14日早晨监测CBZ稳态谷浓度3.35 μg·mL-1(随行质控品实测值为3.85 μg·mL-1，N=10，N2s=2.20，计算即刻法SI上限=1.26，SI下限=1.67)；住院期间患者癫痫症状逐步控制，逐渐减量苯巴比妥至2020年4月18日停用。2020年4月20日临床医师考虑患者病情平稳，建议继续维持CBZ 0.2 g，tid联合拉莫三嗪100 mg，qd，口服抗癫痫药物方案后出院。

2.5.3药学实践分析 基于TDM监测数据，2020年1月1日—2020年4年6日患者CBZ用量0.2 g，bid未调整，稳态谷浓度却下降至4.79 μg·mL-1；2020年4月7日—2020年4月14日患者CBZ用量由0.2 g，bid增加至0.2 g，tid，稳态谷浓度仍持续下降，直至低于正常参考值下限，详见图3，但患者癫痫症状控制尚可，并未再次发作。临床医师希望药师协助分析产生该现象的原因。

图3 CBZ血药浓度变化趋势图Fig.3 Trend chart of carbamazepine plasma concentration

依据“即刻法”室内质控评价理论，该患者4次CBZ血药浓度监测的随行质控品SI上限、SI下限均小于所对应SI界值表的N2s，表明实测值结果在控，提示血药浓度监测数据准确。药师通过与患者家属进行沟通，排除了用药依从性对血药浓度造成的影响，分析导致患者CBZ稳态谷浓度持续降低的可能因素：CBZ口服吸收完全，80%经肝脏CYP3A4代谢为具有类似药理作用的活性代谢产物10，11-环氧卡马西平(carbamazepine epoxide，CBZ-E)[15-16]。CBZ与苯巴比妥均为CYP3A4诱导剂[15]。研究证实，卡马西平可通过自身诱导作用，使其半衰期从35 h缩短为10～20 h[17]。有报道某患者长期服用卡马西平，最初测得CBZ稳态血药浓度为7.19 μg·mL-1，坚持原方案服药，4个月后复测CBZ稳态血药浓度仅2.53 μg·mL-1[18]。另外，苯巴比妥作为肝药酶诱导剂，与CBZ联用亦可加快其代谢，导致CBZ血药浓度降低[19]。此外，拉莫三嗪作为一种新型广谱抗癫痫药物，其虽无明显的肝药酶诱导或抑制作用，但据报道难治性癫痫患者在接受原有抗癫痫方案治疗至少3个月后，加用拉莫三嗪(平均日剂量200 mg)的所有患者CBZ-E稳态浓度均较前明显增加，平均增加约16%。与此同时，部分患者CBZ稳态浓度较前降低约10%[20]。提示，拉莫三嗪与CBZ可能存在其他的潜在药物相互作用，但确切机制尚未明确[20]。

患者出院后，药师定期进行随访，家属代诉癫痫症状控制较好，2021年1月21日门诊复查，未诉特殊不适，监测CBZ稳态谷浓度为7.69 μg·mL-1。由此可见，抗癫痫药物的药动学特征非常复杂，多药联合使用时，开展抗癫痫药物TDM，加强TDM的室内质控评价体系建设，可为临床了解抗癫药物以及合并用药之间复杂的药物相互作用提供大量有价值的信息。

3 讨论

加强TDM的全面质量控制对于确保实验数据的准确性意义重大[21]。通常，室间质评可用于反映实验室测定数据的质量优劣，衡量该实验室的质量控制效果[22]。室内质控则有助于及时发现实验过程产生的误差，确保了室间质评调查成绩稳步提高[23]。2000年国际标准化组织专门针对医学实验室管理制定了ISO/FDIS15189《医学实验室的质量管理》标准，强调应建立实验室内部质量体系。2001年我国也颁布了适合国情的《医疗机构临床实验室质量管理办法》，逐步对临床实验室的室内质量控制实施全面管理。2019年《治疗药物监测工作规范专家共识(2019版)》正式将室内质控纳为TDM 质量控制指标之一[24]。但TDM室内质量控制评价尚无统一标准[5]。

随着分析检测技术的不断发展，TDM技术也在不断推陈出新[5]。目前，国内外在用的CBZ血药浓度检测方法包括HPLC法[25]、CMIA法[26]、荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)法[27]以及灵敏度更高的液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法[28]等。为确保不同TDM方法之间良好的相关性，促进监测结果的准确转换，协助临床医师可参考不同TDM方法的监测数据制定最佳给药方案。建立有效的TDM室内质量控制评价方法显得尤为重要。课题组前期基于Westgard多规则理论，通过绘制Levey-Jennings质控图建立了拉莫三嗪治疗药物监测的室内质量控制体系[10]。但是，笔者所在医院用HPLC法监测CBZ血药浓度的样本量较少，同批次质控品短时间内连续监测20次难度较大。因此，不适宜采用Levey-Jennings质控图开展室内质控，“即刻法”优点则在于同批号质控品只要连续测定3次，即可对第3次及以后的数据进行在控与失控状态评价[4]。故本研究探索性使用“即刻法”进行CBZ治疗药物监测的室内质控并开展药学实践。查阅文献发现，目前将室内质控评价理论应用于TDM的药学服务实践报道较少。谌介秀等[29]首次将质控图联合Westgard多规则法应用于1例肾移植术后长期接受他克莫司抗排斥治疗特殊案例，分析了造成两家医疗机构测定同一血浆样品他克莫司血药浓度测定结果不一致的原因，减少了他克莫司治疗药物监测的误差，提高了医师和患者对TDM结果的信任度。本研究结合实验室CBZ随行质控品监测数据，基于1例症状性癫痫患者HPLC法CBZ血药浓度值波动的案例，应用“即刻法”进行室内质量控制评价，有效保证了监测结果准确性、可靠性。

当然，采用“即刻法”进行室内质控也存在一定的缺陷，即“迟后异常值”现象[3]。表现为在测定次数相对较少时，有些失控的离群值不会显示为警告点，但随着测定次数的增加，测定值逐渐趋于稳定后，以前未显示的离群值将会暴露出来，显示为警告甚至失控的状态。因此，应结合“即刻法”室内质控图及时观察质控曲线的趋势性变化，考虑诸多主、客观因素可能造成的影响，做好日常工作中质量控制培训，严格执行标准化操作流程。总之，课题组结合所在实验室HPLC法CBZ治疗药物监测的送检样本量情况，量体裁衣，制定了“即刻法”室内质量控制评价体系，具有较强的临床适用价值，建议针对临床必需、但监测频次相对较低的血药浓度监测项目推广应用。