苯-砷共存对铜绿微囊藻的毒性和砷累积效应

陈 艳,王振红*,罗专溪,黄明强

（1.闽南师范大学化学化工与环境学院,福建 漳州 363000；2.福建省现代分离分析科学与技术重点实验室,福建 漳州 363000；3.华侨大学化工学院,福建 厦门 361021）

随着工业化和城市化进程的加快，水体富营养化现象严重，与之伴随的金属及有机污染问题也受到普遍关注[1-2].原油泄漏、含油固体废物的随意弃置与含油污水的肆意排放等均可导致水体微量苯污染[3-7]，张晓慧等[8]研究表明水环境中苯含量为0.88%[4]，使其成为我国淡水水体的常见污染物.与此同时Wang等[9]调查发现加拿大近地表水和深层地下水中苯系物的浓度可分别达155 和2.6 μg/L，在1993 至2001年间丹麦近6 000口井水的调查中发现苯占常见有机污染物的8.8%[10].

苯被我国和美国环保署列为优先污染物[11-12]，其作为有毒物质对生态环境和人体健康均具有较高危害[4,13].苯作为最简单的芳香烃苯系物，在水中的最大溶解度为1.8 g/L[6]，对水资源污染风险大[14-15]，是我国水体优先污染物之一.美国规定水中苯的最高允许限值为0.5 mg/L[16]，当前我国规定石油化工行业、涂料工业、农药工业废水中苯的排放限值为0.1 mg/L，排入地表水中苯的排放限值为0.01 mg/L，排入公共污水处理系统的排放限值为0.5 mg/L，而饮用水源中苯的限值为0.01 mg/L[7].

砷在环境中分布广泛，亦是美国环保署优先控制的金属污染物[11].蓝藻水华爆发与水体砷污染不仅影响水环境质量而且制约水资源的开发利用.铜绿微囊藻作为蓝藻水华优势藻种对砷具有高度耐受性，对有机污染如微量苯污染敏感且适应性强[17]，为研究污染物对环境的影响及去除提供了良好的模型[5].

当前我国湖泊水库等淡水水体在遭受有机污染的同时面临着重金属的进一步威胁.有机污染物如苯系物及含苯环类有机农药等的水生态效应备受关注，研究表明低浓度的苯会抑制褐藻SMZ 的生长[5]，低浓度氟苯尼考促进铜绿微囊藻的生长趋势[18]，而硝基苯抑制塔玛藻和巴夫藻的生长，促进海链藻的增殖[19]，且苯环类除草剂对藻类的毒性作用显著[20].与此同时,水中包含微藻等各类微生物对砷的耐受性及在砷生物修复中的应用等相关研究亦相对深入[21,24,30].而关于水体微量有机污染物如苯与砷共存时的生物效应研究相对较少.水中微量苯存在时对水华藻类的毒性效应是否会影响砷的生物适应性与砷的生物累积？并由此影响水体的生态健康及微藻在砷污染修复中的应用？基于此，文中重点探讨了水中微量苯存在时铜绿微囊藻对砷的适应性及藻毒素释放和藻体砷累积特征，以期全面了解和评估苯与砷联合暴露下的水生态环境效应，并为富营养化水体蓝藻水华爆发的科学管控及水体砷生物去除提供一定技术支撑.

1 材料与方法

1.1 藻种来源及培养

铜绿微囊藻FACHB-905 购自中国科学院水生物研究所国家淡水藻种库.用BG11 培养基于温度为(25±1)℃、光暗比为16 h∶8 h、光强为3 000 lx 的培养箱中进行培养，每天振摇3 次.所有工作均在超净工作台进行.

1.2 微量苯存在时铜绿微囊藻对砷的适应性

参照工业废水中苯的排放限值，确定苯的试验浓度为0.1 mg/L，探究其与0～1 000.0 mg/L 的不同浓度梯度As(V)（砷酸钠）共存时铜绿微囊藻对As(V)的耐受性，各处理均设3 个平行.铜绿微囊藻的初始藻密度为1×107cells/mL，并于第0、24、48、72、96 h分别取样观测细胞光密度（OD680）、叶绿素a（Chl-a）和实际光合产率（Yield）值及96 h 上清液中（过0.45 μm 一次性醋酸纤维素滤膜）的总有机碳（TOC）和藻毒素（MCs）浓度.

1.3 微量苯对铜绿微囊藻砷累积与MCs释放的影响

设定铜绿微囊藻藻液中初始As(V)浓度分别为0、0.1 和1.0 mg/L，然后分别向其添加0.1 mg/L 的微量苯，同时将不添加苯（0 mg/L）的处理作为对照，初始藻密度约1×107cells/mL，之后将其放置于光照培养箱中进行为期96 h 的培养（以上处理均设3 个平行）.将培养后的藻液经离心分离并用超纯水清洗后收集藻体，经冷冻干燥后测定藻体中的总砷（TAs）含量，同时上清液过0.45 μm滤膜后分别测定其TOC和MCs浓度.

1.4 测定指标与方法

藻细胞密度以OD680也即在680 nm 下的光密度值表示.叶绿素a（Chl-a）和实际光能转化率（Yield）用高级浮游植物荧光仪（PHYTO-PAM，德国Walz）将新鲜藻液暗适应10 min 后进行测定.总有机碳（TOC）采用岛津TOC分析仪（TOCV-CPH，日本岛津）测定.

介质中释出的MCs含量，采用高效液相色谱仪（Agilent 1200），将样品过0.45 μm滤膜后进行测定，具体参考DB42/T 274-2003和chang等[22-23]的方法，流动相为含0.1%三氟乙酸与甲醇，体积比为35∶65，流速1 mL/min，25 ℃时于波长238 nm 测定.藻体总砷参照王振红等的方法进行处理和分析[24]并使用ICP-MS（Agilent 7800）进行测定.

1.5 数据处理和分析

藻细胞比生长率μ用公式(1)计算[25]：

其中，μ为细胞比生长率/d；ct和c0分别代表时间t和初始时的光密度；t为As(V)添加下的暴露时间/d.抑制率I用公式(2)计算[26]：

其中，I为细胞响应值的抑制率/%.使用GraphPad Prism 8.0 拟合计算半数抑制浓度（IC50）值[27]，并进行作图.拟合曲线：

其中，CAs为As(V)的浓度/(mg/L)；Bottom>0；Top< 100.数据以平均值±标准偏差表示，采用统计软件IBM SPSS Statistics 23进行Pearson相关分析和单因素方差分析（ANOVA）.

2 结果与讨论

2.1 微量苯存在时铜绿微囊藻对砷的适应性

微量苯（0.1 mg/L）存在时铜绿微囊藻在不同As(V)浓度下的OD680随时间的变化如图1a所示.可以看出：除1 000.0 mg/L As(V)浓度下的OD680与其他各组存在显著差异（P<0.01）维持在0.10 并略有降低，其平均比生长率μ为(-0.06±0.02)d；0～100.0 mg/L As(V)浓度下的OD680均随时间线性上升，96 h 内藻细胞增殖无明显差异（P>0.05），其平均比生长率μ为(0.57±0.02)d.这与龚艳等[28]研究中发现的10-3mol·L-1也即75 mg/L 的As(V)对铜绿微囊藻的生长无显著抑制相一致，说明0.1 mg/L 苯的存在没有显著影响铜绿微囊藻对As(V)的适应性，该藻在低As(V)（≤100.0 mg/L）环境下增殖正常.

图1 微量苯存在时不同As(V)浓度下铜绿微囊OD680、Chl-a、Yield值随时间变化Fig.1 Changes in algal cell optical density(OD680),actual photosynthetic Yield(Yield)and Chlorophyll a(Chl-a)of M.aeruginosa with time in the presence of trace benzene at different As(V)concentrations

微量苯（0.1 mg/L）存在时铜绿微囊藻在不同As(V)浓度下的Chl-a 随时间的变化如图1b 所示.可以看出：仅1 000.0 mg/L As(V)浓度下的Chl-a 随时间下降，表现出与其它浓度间的显著差异（P<0.01），0～100.0 mg/L As(V)浓度下的Chl-a均随时间线性上升，其平均比生长率μ为(0.76±0.13)d，各浓度间无显著差异（P>0.05），表现出较高的生长潜能，说明低As(V)（≤100.0 mg/L）环境下微量苯的存在不会显著降低铜绿微囊藻的Chl-a 含量.这与王静等[29]研究得出的低浓度的As(V)可提高铜绿微囊藻细胞Chl-a 的含量，高浓度的As(V)会对微藻产生毒性，造成Chl-a含量显著下降相一致.

光系统Ⅱ（PS）的最大光量子产率（Yield）可以衡量藻体光合活性，在非胁迫条件下Yield 变化很小，但在胁迫条件下，Yield变化较大，是反映微藻生长环境良好与否的一个非常重要的参数[29].微量苯（0.1 mg/L）存在时铜绿微囊藻在不同As(V)浓度下的Yield随时间的变化如图1c所示.可以看出：除1 000.0 mg/LAs(V)浓度下的Yield相对较低为(0.17±0.02)，表现出与其它浓度间的显著差异（P<0.01）外，0～100.0 mg/L As(V)浓度下的Yield 均相对较高为(0.52±0.04)，各浓度间无显著差异（P>0.05）.这说明0.1 mg/L 微量苯存在时该藻细胞的Yield对低As(V)（≤100.0 mg/L）环境具有较好的适应性.

由微量苯环境下As(V)浓度对铜绿微囊藻的OD680、Chl-a和Yield的Pearson相关系数可知，As(V)浓度与OD680、Chl-a和Yield均呈极显著负相关，相关系数分别为-0.492，-0.362，-0.821（P<0.01）；OD680和Chl-a之间及其与Yield 间均呈极显著正相关，相关系数分别为0.932，0.484，0.337（P<0.01）.这说明微量苯存在时Yield 不仅可间接反映该藻在不同浓度As(V)环境下的生长，而且其与OD680和Chl-a 均可响应As(V)的胁迫，As(V)浓度的增加可显著抑制铜绿微囊藻OD680的增殖及Chl-a合成和实际光能转化率.

2.2 砷酸盐对藻的生长胁迫响应

为确定0.1 mg/L 苯存在下As(V)对铜绿微囊藻生长的胁迫特征，测定了不同As(V)浓度下铜绿微囊藻的96 h 生长响应，并对结果进行非线性回归—剂量—响应曲线拟合以得出其96 h IC50（图2）.由OD680、Chl-a、Yield分别得出的96 h IC50如表1所示，结果表明微量苯存在下As(V)对铜绿微囊藻的毒性数据能够用该响应曲线很好地进行拟合.由OD680、Chl-a、Yield三个指标的方差分析得出铜绿微囊藻在不同砷浓度下的96 h无可观测效应浓度（NOEC）和最低可观测效应浓度（LOEC）一致，分别为100.0，1 000.0 mg/L.这与先前研究得出的在不含苯时由OD、Chl-a 和Yield 分别计算出的As(V)对该藻的96 h NOEC 和LOEC 分别为105和106μg/L 结论一致[30]，说明0.1 mg/L 苯的存在不影响该藻对As(V)的NOEC 和LOEC.最大允许毒物浓度（MATC）依据MATC=得出由OD680、Chl-a、Yield 所指示的As(V)的MATC 为316.23 mg/L.

图2 0.1 mg/L苯下As(V)对铜绿微囊藻96 h的生长胁迫及非线性回归-剂量-响应曲线拟合Fig.2 Nonlinear regression dose-response curve fitting of M.aeruginosaunder growth stress of As(V)at 0.1 mg/L benzene for 96 h

对比有无微量苯存在时As(V)对铜绿微囊藻的毒性效应（表1）数据可以得出：不含苯（0 mg/L）时As(V)对铜绿微囊藻的96 h EC50以OD680为最高，其次是Chl-a，Yield 最为敏感，较Chl-a 和OD680要低近3 个数量级[29].而0.1 mg/L 苯环境下As(V)对铜绿微囊藻的96 h IC50表现为：Chl-a

表1 有无苯存在时铜绿微囊藻由各生长指标得出的As(V)的96 h IC50(mg/L)Tab.1 96 h IC50(mg/L)of M.aeruginosa As(V)obtained by growth indexes in the presence and absence of benzene

2.3 微量苯与砷共存时介质中的TOC和MCs

微量苯（0.1 mg/L）存在时铜绿微囊藻在不同As(V)浓度经96 h培养后其介质中TOC和MCs的含量如图3所示(图中字母表示不同处理间的差异显著性，P<0.05).0.1 mg/L苯存在时随As(V)浓度的增加，介质中TOC 呈现先增加后降低的趋势（图3a），且以5.0 mg/L 时的TOC 含量最高，为(0.35±0.03)mg/L，与0.5，1.0，10.0，100.0，1 000.0 mg/L的As(V)处理组无显著差异（P>0.05）.无砷环境下0.1 mg/L苯的处理组中TOC含量最低，为(0.18±0.03)mg/L，As(V)的添加促进了微量苯环境中铜绿微囊藻向介质中TOC的释出，说明铜绿微囊藻可通过向外界环境释放较多的有机物来缓解As(V)的毒性，这与Zhang等[32]研究的小球藻胞外高分子物质（EPS）能减少细胞内砷吸收的结论相一致.

As(V)浓度为1.0 和1 000.0 mg/L 时MCs 含量最低，均值为(0.38±0.01)mg/L，其余As(V)浓度时的MCs含量均呈降低趋势（图3b），说明1.0 mg/L As(V)时MCs的释出最少，而As(V)浓度为0和100.0 mg/L时MCs 释出最多，均值为(0.62±0.02)mg/L，说明这两种环境下有利于MCs 的释出.微量苯存在时介质中MCs含量与As(V)浓度呈显著负相关（P<0.05），相关系数为-0.439，与OD680呈显著正相关（P<0.05），相关系数为0.458；与Chl-a、Yield 均呈非显著正相关（P>0.05），相关系数分别为0.341 和0.366；与TOC 呈不显著负相关（P>0.05），相关系数为0.399，说明藻细胞的增殖会产生较多的MCs，而介质As(V)浓度和溶解性有机物的增高一定程度上表现为降低MCs的释出，这与刘烜瑜等[33]研究得出铜绿微囊藻分泌的EPS可以减少溶液中藻毒素含量的结论一致，可能的原因是溶解性有机物（DOM）能介导间接光降解去除地表水中MCs[34]，与研究结果有机物含量的增高能减少介质中MCs的含量一致.

图3 微量苯(0.1 mg/L)与不同As(V)浓度共存时铜绿微囊藻培养介质中TOC和MCs的变化Fig.3 Changes of TOC and Microcystins in M.aeruginosa culture medium when trace benzene(0.1 mg/L)coexisted with different As(V)concentrations

2.4 微量苯对铜绿微囊藻砷的累积与MCs释放的影响

2.4.1 有无微量苯存在时不同As(V)环境下介质中的TOC和MCs

有无微量苯存在时铜绿微囊藻在0.1和1.0 mg/LAs(V)环境下经96 h暴露后介质中TOC和MCs含量如图4a 所示(图中字母表示不同处理间的差异显著性，P<0.05).可以看出1.0 mg/L As(V)介质中TOC 含量最高，为(0.57±0.06)mg/L，其含量高于不含苯与As(V)的正常培养组中的TOC，As(V)的存在一定程度上促进了微量苯环境下介质中TOC 的释出，说明该藻可以通过EPS 的释放来达到对高浓度As(V)的解毒[32,35]；0.1 mg/L 苯环境中的TOC 含量最低，为(0.18±0.03)mg/L，说明微量苯的存在可显著减少藻体胞外有机物的释出，其进一步表现为降低含As(V)环境下藻体向介质中释放的TOC 含量，并削弱了0.1和1.0 mg/L As(V)环境下介质中TOC含量间的显著差异，一方面可能是由于苯作为有机物在环境中的存在限制了同类胞外有机物的释出，另一方面苯作为疏水性有机物通过增强对胞外有机物的生物吸附作用进而使介质中TOC 的含量降低，与先前Wang等[36]人研究得出的天然有机物（NOM）通过疏水相互作用增强与铜绿微囊藻EPS之间的生物吸附结论一致.

由图4b MCs 的变化可以看出正常培养的铜绿微囊藻介质中MCs 的含量与0.1 mg/L 苯环境中的MCs含量最高且无显著差异（P>0.05），为(0.62±0.03)mg/L；微量苯与1.0 mg/L As(V)共存时介质中MCs的含量最低为(0.38±0.01)mg/L，表现出与其他处理组的显著差异（P<0.05）.As(V)的存在可显著降低微量苯（1.0 mg/L）环境中藻毒素的释出含量，说明As(V)在一定程度可缓解微量苯污染时蓝藻水华的藻毒素释出风险，微量苯的存在无显著改变0.1 mg/L As(V)环境中MCs的释出，但降低了1.0 mg/L As(V)环境中MCs的含量.As(V)的存在可显著降低微量苯（1.0 mg/L）环境下MCs的释出.MCs是环七肽化合物，需要通过转运蛋白的运输才能通过细胞膜[37]，有机物分子会影响微生物的生物膜透过性[38]，故微量苯的添加显著减少了MCs的释放.

图4 有无微量苯存在时铜绿微囊藻96 h上清液TOC和MCs的变化Fig.4 Changes of TOC and Microcystins in M.aeruginosa 96 h supernatant with or without trace benzene

2.4.2 藻体砷累积

有无微量苯存在时铜绿微囊藻在0.1 和1.0 mg/L As(V)环境下经96 h 暴露后藻体内的TAs含量如图5所示(图中字母表示不同处理间的差异显著性，P<0.05)，无微量苯存在时藻体TAs含量分别为(40.70±1.46)和(270.80±51.37) µg/g，0.1 mg/L 苯的存在一定程度上促进了藻体TAs 含量，使其TAs 含量分别增加46.97%和35.24%，微量苯的存在显著提升了铜绿微囊藻对这两种浓度下As(V)的累积（P<0.05）.这可能是由于微量苯的存在使得介质中溶解性有机物（DOM）含量降低，进而减少了As-DOM 二元配合物的形成，提高了As(V)的游离度，进而促进了细胞对As(V)的吸收.研究结果与Zhang等[32]和Naveed等[35]研究得出EPS 的分泌可有效促进砷的表面吸附，限制其进入细胞内的吸收相一致.尽管不同于徐西蒙等研究认为的有机物分子会影响微生物的生物膜透过性，阻碍金属离子进入生物膜，继而改变其迁移方式[38]，具体分析可能是受苯作为疏水性有机物能与藻体释出的EPS相结合进而产生不同效应[35].

图5 有无微量苯存在时铜绿微囊藻细胞总砷含量Fig.5 Total arsenic content in M.aeruginosa cells with and without trace benzene

3 结论

微量苯（0.1 mg/L）存在时对As(V)浓度低于100 mg/L 时铜绿微囊藻的增殖和光合作用无显著影响，但显著增强了藻体Chl-a 和OD680对As(V)的敏感性，使其IC50显著降低，Chl-a 成为反应铜绿微囊藻对As(V)适应性的敏感性响应指标.与无苯环境下铜绿微囊藻经不同浓度As(V)处理相比较，微量苯的存在可显著促进铜绿微囊藻对As(V)的累积，同时减少了含As(V)环境下藻体向介质中TOC的释放，降低了环境中MCs的释出风险.与不含As(V)时微量苯环境下铜绿微囊藻向介质中释出的TOC与MCs相比As(V)的存在一定程度上可促进微量苯环境下介质中TOC释出，并显著降低该环境下MCs的释放风险.研究结果对深入了解微量苯污染环境下含砷水体的水生态风险及微藻生物处理技术的应用具有重要意义.