多肽原料药的分析和表征

王二琴

（上海昂博生物技术有限公司 上海 201417）

多肽的相对分子质量介于典型的有机小分子和高分子化合物之间。一般来说，多肽是由≤50 个氨基酸通过肽键连接而成的化合物。多肽广泛存在于人体内，并具有重要的生理效能，而多肽类药物也早已用于临床治疗糖尿病和某些癌症等[1]。随着多肽类药物的不断出现，多肽相关的分析检测研究的重要性亦日益凸显[2]。

质量是保障药品安全性和有效性的基础。在制药企业按药品生产质量管理规范要求进行多肽原料药生产时，如果没有严格的分析、表征和杂质检测，产品就会出现问题并可能造成非常严重的后果。本文概要介绍多肽原料药的分析、表征及其检测项目。

1 指导原则

质量控制部门是药品质量控制的重要组成部分，产品的各项检测结果只有符合预先制定的指标才能放行。对于原料药，人用药品注册技术要求国际协调会发布的协调指导原则Q7 部分论述了需要进行的检测项目和建立规范标准的过程。

随着市场上多肽类药物越来越多，药品监管机构必须确立各种多肽原料药的质量控制参数。为了确保生产的药品的高质量和一致性，多肽原料药的分析和表征必须考虑采用多项质量控制参数，以确保药品质量保证部门能够在放行产品之前充分评估产品的质量。

2007 年10 月，国家食品药品监督管理局发布了《合成多肽药物药学研究技术指导原则》，后者结合国内对多肽药物研究和评价的实践经验，对多肽药物各项药学研究提出了一般性要求。多肽原料药的质量与其生产工艺关系密切，且即使源自同一生产工艺的产品，不同生产批次的产品的质量也可能不同[3]。因此，多肽原料药的结构完整性表征和质量检测至关重要。下面从鉴别、检验（纯度）、含量测定和其他一般属性检测几个方面来介绍多肽原料药的分析和表征。

2 分析和表征

2.1 鉴别

鉴别主要是为了确认多肽的结构，即确认产品的身分同一性。多肽的鉴别不是简单、单一的检测就能完成的，其一级结构的确证一般采用质谱测定相对分子质量，色谱测定氨基酸组成，质谱结合酶切或采用Edman 降解测定肽序[4]。Edman 降解是一种传统的、有效的肽序测定方法，但一般不适用于氨基末端封闭或呈环状的多肽；质谱检测的多肽所含的氨基酸个数通常不宜超过25 个，否则会导致数据解析困难。多肽的二级结构实际上是肽链因氢键而形成的局部结构，其确证一般有X 射线单晶衍射、核磁共振、红外、紫外、圆二色谱等检测方法。多肽结构的鉴别常用到且不限于上述检测方法。由于每种检测方法只能获得多肽结构的一些特定信息，故采用正交表征方法是确保能够准确鉴别多肽二级结构的关键[5]。一般而言，采用磁共振、红外、紫外检测和进行氨基酸组成分析即可获知短肽的结构特征，但对于中、长肽，则还需要进行氨基酸序列分析并结合质谱检测来确证肽序的准确性，即需要进行更多的检测和分析并对所得信息进行综合解析与归属。必须指出的是，如果能够得到多肽标准品，可将多肽待检品与标准品的光谱图进行比对，由此大大简化和方便多肽的鉴别。多肽的鉴别需要设定哪些检测指标，取决于多肽的生产工艺、链长特点及其与检测方法的匹配度。根据药典的要求，鉴别中提到的“检测”必须能够达到检测的目的。

2.2 检验（纯度）

检验（纯度）部分主要用来限制有关物质中的杂质，检测多肽的纯度和完整性。除目标肽外，其他的肽均可视为杂质，主要包括与目标肽结构相似的工艺相关杂质和降解产物、聚合物、残留溶剂、主成分离子、水分等。工艺相关杂质是指在多肽合成生产过程中产生的相关杂质。如在多肽合成生产过程中，为了防止发生不希望的侧链反应，会引进许多侧链保护基，而后又会根据需要清除侧链保护基。由于这些化学反应不是100%的完全反应，故最后侧链保护基仍可能附着于目标肽上，导致多肽相关物质的出现。另外，无论生产工艺如何，由于化学不稳定性，多肽的降解产物都可能会产生。多肽一般通过水解、氧化、外消旋化等不同机制[6]而产生降解产物。

高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography， HPLC）是用于多肽及其相关杂质的鉴别、分离和定量的主要方法[7]，杂质能否被检出、分离和鉴别是衡量所用方法好坏的重要依据之一。在执行药品生产质量管理规范的制药企业中，质量控制部门也需负责开发产品分析方法并随后进行验证以确保其准确性。通常，对于第一批生产的多肽原料药，HPLC 纯度要求不低于97%，同时要求其他单一杂质含量不超过1%。药典中的多肽原料药一般都有规格和杂质限度要求。杂质可以指定或不指定，取决于它们存在的含量。杂质的限度应大于其检出限度，报告格式一般为“不超过”。

聚合物是由于产品物理不稳定性而导致的通过表面吸附、聚集或沉淀所产生的杂质，一般通过排阻色谱法检测单体和聚合物的含量。元素和有机试剂杂质往往来自产品合成和纯化工艺中所使用的材料、试剂和设备的浸出等。人用药品注册技术要求国际协调会发布的协调指导原则Q3D 和Q3C 部分分别论述了产品在不同给药途径时需要检测的元素杂质和残留溶剂的类型及限度。

关于有关物质的分析方法及其检测限度可依据国家食品药品监督管理局有关部门2004 年发布的《化学药物杂质研究的技术指导原则》进行研究和确定，所采用的分析方法必须能够有效分离工艺相关杂质、降解产物和聚合物等。一般需要对两种以上的分析方法进行比对研究。需要指出的是，对于多肽，不同色谱柱的洗脱效能差异很大。目前市场上有很多多肽分析色谱柱，如选用得合适，可以明显改善多肽原料药的杂质分离度。

对多肽主成分离子（如醋酸根、盐酸根和三氟乙酸根）及水分的检测，反相色谱法和离子交换色谱法是最常用的方法。反相色谱法主要用于检测三氟乙酸根和醋酸根，但其检测范围较窄，且杂质峰多而明显，分离效果可能不佳。不过，反相色谱柱能耐受有机溶剂，故对水不溶的多肽样品，可先添加少量有机溶剂溶解，然后再用反相色谱法进行检测。相比之下，离子交换色谱法一般不能使用有机溶剂，否则会损害色谱柱的。当然，有些情况下可以改用特殊的离子交换色谱柱。

水分测定多用卡尔·费休滴定法。水份不仅是产品放行的重要指标，也是产品稳定性试验中常用的考察指标。卡尔·费休滴定法可按原理分为库仑滴定法和电位滴定法，其中库仑滴定法灵敏度高，适用于痕量水分检测，对于含量偏高的水分检测，则耗时较长。可根据多肽原料药的亲疏水性来选用不同的水分测定方法。药典也依据多肽的亲疏水性，给出了水份不超过3% ～ 14%的规定。

2.3 含量测定

含量（效价）测定是评价多肽原料药质量的主要指标之一。药典中通常采用比较色谱法（样品称重时须在有温度和湿度控制的条件下进行）来测定，以确定的化学对照物质为标准，但必须有足够的定量对照标准品（其本身必须经过全检分析）。指标通常以无醋酸或无水多肽表示。这种检测的允许限度通常是非对称的，上限为100%＋允许的试验重复性（通常是2.0%），下限为100%－（允许的试验重复性＋最大允许杂质水平）[8]。采用比较色谱法的前提是必须有足够的定量对照标准品。

多肽的含量测定也可很容易地由氨基酸组成分析结果来确定，通过计算检测到的每种氨基酸的摩尔含量得到样品的总质量。这种方法的缺点是在多肽水解过程中有些氨基酸如色氨酸等可能会被破坏而导致检测结果不准确。其他方法包括通过元素分析进行氮测定、凯氏定氮分析和在HPLC 检测中使用氮特异性检测器等，但这些方法对氨基酸衍生氮没有特异性，容易产生系统误差。

2.4 其他检测

除了上述重要的质量属性之外，质量控制还须考虑是否需要检测产品的其他属性，如一般属性，包括外观、色泽、溶解度、澄清度、酸碱度、可见异物、旋光性和质量平衡等。这些属性都是多肽原料药质量控制的一般要求，同时也能证明产品批与批间的一致性。溶液的澄清度及其色泽、酸碱度是原料药质量控制的重要指标，通常应做此两项检查，特别是对注射用多肽原料药。此外，大多数多肽通过注射或口服给药，故有微生物和内毒素检测要求。

从质量平衡的角度讲，多肽原料药的检测应该对其多肽、主成分离子和水分含量之和进行控制，一般要求控制在100%±5%，以确保没有大量的无机盐或其他不明杂质的存在[9]。

3 小结

对于多肽原料药生产，建立全面、可靠的质量控制指标是建立可重复的生产工艺的必要前提。上述鉴别、检验（纯度）、含量测定和一般属性检测是多肽原料药全检的必要组成。根据不同多肽的不同生产工艺，多肽原料药的分析、表征内容可适当调整。多肽原料药只有通过了所有的预定质量检测后才能被放行使用。