高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法测定土壤中的4 种硒形态

2022-03-25刘进玺周晓华王铁良

农产品质量与安全 2022年2期

刘进玺周晓华王铁良郭洁张迪贾斌魏红

（河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量监督检验测试中心，郑州 450002）

硒（Se）是人体的必需微量元素[1]，参与合成人体内多种含硒酶和含硒蛋白[2]，具有清除体内自由基、抗氧化作用，可以延缓器官老化与病变，提高免疫力，能够抑制癌细胞生长及其DNA、 RNA和蛋白质合成[3]，抑制癌基因的转录，干扰致癌物质的代谢。因此，硒也被称为 “抗癌之王”。 2017年发布的WS/T 578.3－2017 《中国居民膳食营养素参考摄入量第3 部分：微量元素》标准规定我国18～50 岁成年人，硒元素日平均需要量为50μg。硒元素是人体无法合成的元素，植物是人体摄取硒元素的重要来源。而植物中硒元素的含量除了与植物的种类特性有关外，还与土壤中硒元素的有效性密切相关[4～6]。土壤中硒的有效性不仅取决于总硒的含量，还与硒的形态有关。因此，对土壤中硒形态的准确测定意义重大。

硒元素的主要存在形态分为元素态硒、无机态硒和有机态硒。元素态硒和无机态硒主要存在于环境中，而有机态硒主要存在于生物体内[7]。土壤中能被农作物吸收利用的有效硒主要有水溶态和可交换态的硒酸根［Se（Ⅵ）］离子、亚硒酸根［Se（Ⅳ）］离子，以及包括硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸等在内的有机硒小分子。目前，关于硒形态的测定方法研究主要集中在高效液相色谱－电感耦合等离子体串联质谱法和高效液相色谱－氢化物发生－原子荧光光谱法[8～18]。其中，高效液相色谱－电感耦合等离子体串联质谱法具有较高的灵敏度、较宽的线性范围和较低的检出限，但是由于其仪器价格昂贵，多数基层单位并未配置，应用不够广泛；利用高效液相色谱－氢化物发生－原子荧光光谱法测定硒形态的研究大多集中在稻谷、大豆、酵母等富硒样品上，对土壤的研究很少，仅见报道李爱民等[18]利用高效液相色谱－原子荧光光谱法测定土壤中4 种有效硒形态，其提取直接采用NY/T 3420－2019 中的方法，没有进行进一步优化。笔者所在课题组收集了河南多个地区不同富硒农作物生长环境的土壤，针对所搜集到的样品，进行了从提取溶剂、提取方式、仪器条件等一系列的优化，建立了高效液相色谱－氢化物发生－原子荧光光谱法测定土壤中硒酸根、亚硒酸根、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸（SeCys）4 种硒形态的方法。

一、材料与方法

（一）主要仪器及试剂材料仪器设备：SA－10 液相色谱－原子荧光光谱联用仪（北京吉天仪器有限公司）； Milli－Q 超纯水发生器（美国Millipore公司）。试剂：盐酸（优级纯，国药集团）；氢氧化钾、碘化钾、氢氧化钠、柠檬酸溶液、乙酸铵溶液、磷酸氢二铵（分析纯，国药集团）；硒酸根、亚硒酸根、硒代蛋氨酸标准品（中国计量科学研究院）；硒代胱氨酸标准品（美国BOC Sciences 公司）。

（二）标准溶液的配制准确称取10 mg（精确至0.01 mg）各个标准品于10 mL 容量瓶中，分别加入适量超纯水溶解并定容，摇匀，得到4 种标准品的单一标准储备液，换算为以硒计的质量浓度。将上述标准储备液放置于4℃的冰箱中，备用。

使用时将单一标准储备液用水稀释成适宜浓度的单一标准工作液。分别吸取一定量的标准工作液，配制成混合标准储备液，临用前稀释成合适浓度的混合标准工作液。

（三）仪器条件液相色谱条件：Hamilton PRP－X100 色谱柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；流动相为60 mmol/L 的磷酸氢二铵溶液（pH 6.0），流速为1.0 mL/min，进样量为100 μL。

氢化物发生条件：载流为10%HCl；还原剂为2%KBH4含0.5%KOH、 0.1%KI 含0.5%KOH。

原子荧光检测条件：硒空心阴极灯，灯电流为90mA；负高压为290V；载气、屏蔽气为氩气，流量分别为300、 500 mL/min；原子化器高度为10 mm。

（四）样品制备样品采集后，置于室内干净整洁的通风处，自然风干，剔除其中的植物残体、石块等，样品磨碎后过60 目筛，作为待测试样。

（五）样品前处理称取2 g （精确至0.01 g）土壤样品于250 mL 具塞三角瓶中，加入100 mL 0.08 mol/L NaOH 溶液，超声30 min 后振荡16 h，取10 mL 上清液，在10000 r/min 条件下离心12 min，取上清液过膜（0.22 μm）后待上机。

二、结果与讨论

（一）仪器条件的选择用来分离硒形态常用的色谱柱主要有C18柱和离子交换柱[19～20]，本文分别尝试使用了岛津C18色谱柱和Hamilton PRPX100 离子交换柱，以柠檬酸溶液、乙酸铵溶液、磷酸氢二铵溶液作为流动相来优化4 种硒形态的分离情况，结果发现，使用Hamilton PRP－X100 离子交换柱，并使用磷酸氢二胺作为流动相时，4 种硒形态的分离度和峰形最佳，因此确定色谱柱为Hamilton PRP－X100 离子交换柱。接下来进一步优化磷酸氢二铵的浓度和酸度，结果表明，当磷酸氢二铵的浓度为60 mmol/L、 pH 为6.0 时，4 种硒形态的分析时间适当，分离度达到要求，因此确定流动相为60 mmol/L 的磷酸氢二铵溶液（pH 为6.0）。4 种硒形态的标样图谱见图1。

图1 40 μg/L 4 种硒形态标样图谱

（二）提取溶剂的选择在河南省内种植富硒农产品的土地上取样，共在新乡市原阳县、开封市、新乡市新乡县、济源市等地抽取土壤样品76份，测得pH 范围为7.65～8.77，全硒含量为0.06～5.49 mg/kg。本研究首先选取全硒含量为5.49 mg/kg的土壤样品作为实验对象，对提取溶剂进行优化。

分别选取100 mL 水、添加30 mg 链霉蛋白酶的100 mL 水、 100 mL 0.01 mol/L 的NaOH 溶液、100 mL 体积分数为10%的HCl 溶液、 100 mL 90 mmol/L 的Tris－HCl 缓冲液（pH 7.5）、 100 mL 体积分数为10%的硝酸溶液作为提取溶剂，对土壤样品进行实验。结果表明，体积分数为10%的HCl 溶液作为提取溶剂时，峰位置发生了迁移，且峰形不佳，因此排除该溶液。其他5 种提取溶剂提取到的均为硒酸根，其中0.01 mol/L 的NaOH 溶液作提取溶剂时，提取效率最好，说明碱性溶液的提取效果最佳。又进一步优化碱液的种类和浓度，实验比较了0.005、 0.01、 0.02、 0.05、 0.08、 0.10 mol/L 的NaOH 溶液，0.05、 0.10、 0.20 mol/L 的Na2CO3溶液和0.05、 0.10、 0.20 mol/L 的K2HPO4－KH2PO4缓冲液的提取效果。结果表明，NaOH 溶液作提取溶剂时提取效率最好，当NaOH 溶液浓度在0.005～0.10 mol/L 范围内不断提高时，硒酸根的提取效率出现先增高后下降的趋势，当NaOH浓度为0.08 mol/L 时，提取效率最高，因此确定使用0.08 mol/L 的NaOH 溶液作为提取溶剂。

（三）提取方式的选择实验比较了超声30 min、超声30 min 后浸泡静置4 h、超声30 min 后浸泡静置8 h、超声30 min 后浸泡静置16 h、超声30 min 后振荡4 h、超声30 min 后振荡8 h、超声30 min 后振荡16 h 和超声30 min 后振荡20 h 的提取效果。结果表明，超声后振荡提取的效果优于仅超声和超声后静置的效果；超声30 min 后振荡提取，随着振荡时间的增长，提取效率逐渐提高，但振荡时间为16 h 后，随着振荡时间的增长，提取效率基本保持不变，这说明当超声30 min 后再振荡16 h 时，土壤中的有效硒已经提取完全，因此确定超声30 min 后振荡16 h 为提取方式。

（四）方法学评价

1.线性关系和定量限。吸取适量的混合标准储备液，分别配制成5、 10、 20、 40、 80、 100 μg/L的混合标准工作液，在前文所述仪器条件下进行实验。以各个化合物的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性关系标准曲线。结果显示，4 种化合物的相关系数范围为0.9991～0.9995（见表1）。选取空白样品做添加回收实验，添加量范围为0.10～1.0 mg/kg，实验结果得出，当硒酸根和亚硒酸根的添加浓度为0.25 mg/kg、硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的添加浓度为0.50 mg/kg 时，上机液的图谱峰形对称、清晰可辨，可准确积分，5 个平行的回收率在72.3%～81.6%之间，相对标准偏差在5.4%～8.7%之间，符合实验室相关法规的要求。因此，确定硒酸根和亚硒酸根的定量限为0.25 mg/kg，硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的定量限为0.50 mg/kg （见表1）。

表1 4 种硒形态的线性关系和定量限

2.准确度和精密度。选取本底不含硒酸根、亚硒酸根、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的土壤样品进行添加回收实验，实验设3 个浓度水平，每个浓度水平重复5 次，实验结果见表2。 4 种硒形态的平均回收率为72.3%～94.6%，相对标准偏差（RSD）为4.3%～8.7%。结果表明，该方法的准确度和精密度满足实验室相应法规的要求，可以用于准确定量。

表2 4 种硒形态添加回收实验结果

3.实际样品的测定。选取全硒含量不同的土壤样品，依据NY/T 3420－2019 测定土壤样品中的有效硒，并依据本文建立的方法进行硒形态的分析，测得土壤中的有效硒形态均为硒酸根，其含量占全硒含量的23.6%～43.0% （见表3）。该结果表明，所抽取土壤样品中不含有硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和亚硒酸根，绝大多数样品中4 种常见硒形态之和占全硒含量不足50%，土壤中大部分硒的存在形式可能是残渣态或强有机结合态[21]，具体情况需在后续工作中继续探讨。