基于生物技术的农产品质量安全快速检测方法研究进展

2023-01-04郝立武张书宏郑百芹

农产品质量与安全 2022年2期

侯蔷郝立武张书宏周鑫张谊郑百芹

（唐山市食品药品综合检验检测中心，河北唐山 063000）

食品安全是国家的重大战略需求。我国的食品安全检测于2000年左右开始兴起，至今已基本建成了食品质量安全保障体系和全过程监管体系，逐步健全了安全标准体系，重大食品安全风险得到控制。然而，由于农药、兽药违规滥用等引发的农产品质量安全事件仍时有发生，使消费者对食品安全缺乏信心。

农产品质量安全检测常用的是传统实验室大型仪器检测方法。随着有关部门对农产品质量安全监管的重视，安全抽检任务日益加重；而农产品流通交易时间较短，数量较大，传统实验室检测周期长，难以及时发现和控制问题，因此对于农产品质量安全快速检测方法的需求日益凸显。 2015年10月1日起实施的新修订的《中华人民共和国食品安全法》，对快速检测方法的法律地位进行了调整，从初步筛查转变为抽查检测，抽查检测的结果确定不符合食品安全标准的，可以直接作为行政处罚的依据[1]。

相较于大型仪器检测方法，快速检测方法样品前处理简单，对设备要求不高，分析方法简便、快速，能在较短时间内完成，尤其适用于现场快速检测。目前快速检测方法的开发主要基于生物技术、光谱学技术、化学技术等[2～5]，本文主要介绍近年来基于生物技术的农产品质量安全快速检测方法的开发、研究现状及应用情况，并展望了未来的研究方向与发展趋势。

一、酶抑制技术

酶抑制技术是基于某些物质对酶的抑制作用而进行分析的方法，主要应用于农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测，常用的酶类包括胆碱酯酶和羧酸酯酶等，具有简单、快速、灵敏，对仪器设备要求不高且应用范围广等优点。 YANG 等[6]建立了一种快速测定牛奶中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶抑制反应体系，农药的检出限为0.5～1.0 mg/kg。基于酶抑制技术的快速检测方法，虽然存在准确度不高、选择性差、时有干扰等局限性，但依然是目前有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测的主流方法。研究人员也在尝试利用多种方式，优化酶抑制技术以提高其相关产品的性能。JIN 等[7]改进了乙酰胆碱酯酶抑制分析方法，开发了一种通过有机溶剂萃取结合自发性原位溶剂蒸发的纸基微流控分析系统，使其分析性能得到了显著提高。 WU 等[8～9]将酶抑制技术与金纳米材料有机结合开发了一种比色方法，利用金颗粒在不同价态形式下呈现的颜色不同，来指示有机磷农药的浓度，在最佳条件下，观察到的最小比色浓度为0.7 mg/L，大大提高了检测灵敏度。 QING 等[10]同样采用了基于金纳米材料的酶抑制技术，建立了一种可快速检测有机磷农药的方法，以三唑磷作为模型农药进行验证，在最优条件下的检测限为4.69 nmol/L。这种利用金纳米材料的高灵敏度，对现有的酶抑制技术预处理方法进行改进优化的方法，在未来有机磷农药残留的快速检测领域有较为广阔的应用前景[11]。

二、免疫学技术

（一）酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法是目前常用的应用免疫学技术的方法之一，其基本原理是充分利用了抗原－抗体结合的特异性和酶高效催化底物的特性，通过酶作用后显色的颜色深浅来达到定性或定量检测样品中待测物的目的[12]。ELISA 主要包括直接竞争法、间接竞争法和双抗夹心法等，具有操作简单、相对成本低、预处理速度快、可以高通量分析等优点[13]。 ZHANG 等[14]建立了一步间接竞争ELISA 法，用于快速、特异地检测动物源性农产品中的地克珠利残留，可在50 min内完成对样品的分析。 LI 等[15]制备了特异性一致且亲和力高的抗菌增效剂单克隆抗体，并建立了间接竞争ELISA 方法，用于鸡肉和牛奶中抗菌增效剂的检测，检出限分别可达0.06 ～0.8 μg/kg 和0.05～0.6 μg/L。 YANEVA 等[16]制备了抗敌敌畏和对氧磷的绵羊多克隆抗体，并在此基础上建立了间接竞争ELISA 法，用于生鲜乳中敌敌畏和对氧磷残留的快速筛查。间接竞争法需要使用酶标二抗，操作步骤相对复杂，相比较而言直接竞争法更加快速便捷。 WU 等[17]建立了适用于氯霉素残留检测的直接竞争ELISA 法，通过方法学验证及实际样品检测，证明此方法具有足够的灵敏度用于检测农产品样品中的氯霉素残留。

ELISA 法所使用的抗体，包括通用抗体和广谱抗体。通用抗体的制备对于免疫原的设计要求较高，且无法保证抗体对待测物具有一致的亲和力；而广谱抗体的制备，虽然使用的是 “多半抗原策略”，但所获得的抗体对待测物亲和力较低[18]。因此，基于抗原－抗体的ELISA 方法存在一定的局限性，需要开发更易获取、高效稳定、特异性强的识别元件，以弥补抗体制备技术的不足。 XIANG等[19]开发了一种基于适配体的ELISA 方法，将适配体的生物识别功能与酶信号放大功能相结合，用于检测蔬菜、水果中的水胺硫磷，检测限为0.05 ng/mL，灵敏度优于传统的ELISA 方法。 WANG等[20]合成了一种分子印迹聚合物作为仿生抗体，基于此开发了可用于检测动物源性农产品中恩诺沙星的ELISA 方法，检测限为1.1 ng/mL，结果与高效液相色谱法测定结果一致。适配体和分子印迹聚合物作为新型识别元件，具有制备快速简单、稳定性强、特异性好、易于保存等优点，与传统ELISA方法结合，可扩大检测适用范围。

（二）免疫层析法免疫层析（Immunochromatographic assay，ICA）法是基于层析技术和抗原－抗体特异性结合而发展起来的一项快速检测技术，具有操作简单、检测速度快、成本较低、高通量等优点[21]。其基本原理是将抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜的检测线上，二抗固定在质控线上，在毛细管层析作用下，标记后的抗体与待测物随样本溶液在硝酸纤维素膜上流动，并与检测线及质控线上的抗原或抗体发生高特异性、高亲和性的免疫反应，通过检测区域标记抗体信号强弱的变化可对样品中的待测物进行定性、半定量以及定量检测[22]。

随着科技的发展，用于标记抗体的标记物的种类也呈现出多样化发展，包括胶体金、荧光纳米颗粒、量子点、上转换发光颗粒等[23～26]。其中，胶体金是应用最为广泛的抗体标记材料，合成技术最为成熟，是由氯金酸还原后聚合成的金颗粒形成带负电的疏水胶溶液，其颜色肉眼可见且稳定性高[22～23]，基于此开发的主要产品为胶体金免疫层析试纸条。如WU 等[17]研发了可用于检测食品样品中氯霉素的免疫层析试纸条，检测限为0.5 ng/mL，可在10 min 内完成检测。 GAO 等[27]研究建立了一种适用于检测鸡肉样品中金刚烷的ICA 方法，并与ELISA方法进行比较，结果非常相似，为现场快速检测提供了一种有力工具。

基于传统通用抗体的ICA 方法在高通量检测方面存在一定的局限性，即一种产品只能检测特定的一种参数。近年来，基于广谱抗体的ICA 方法开发逐渐成为研究重点，其可用于同时检测多种参数。 GUO 等[28]开发了一种可同时检测鸡胸肉中卡巴氧和喹赛多残留的胶体金免疫层析试纸条，检测限分别为2.92、 2.68 μg/kg，并通过液相色谱－串联质谱法进行了验证。 HAN 等[29]研发了一种八联侧流免疫分析方法，可同时对牛奶中喹诺酮类、四环素类、 β－内酰胺类、磺胺类、氯霉素、链霉素、黄曲霉毒素M1和三聚氰胺8 类药物残留开展定性或半定量分析，检测时间＜20 min。 WANG 等[30]利用荧光纳米颗粒标记的非特异性单克隆抗体建立了一种ICA 方法，可在8 min 内快速筛查猪肉中7 种β－激动剂，检测限＜50 pg/g。 PENG 等[31]利用一种具有广泛特异性的单克隆抗体，开发了可同时检测32 种喹诺酮类药物的ICA 方法，检出限为0.1～10 ng/mL。然而，受抗体亲和性较低及成本较高的限制，市售的此类检测产品较少，应用范围不及传统的ICA 快速检测产品。

（三）生物芯片法生物芯片法是以硅芯片、玻璃芯片或高分子聚合物薄片为载体，利用DNA或蛋白质等生物大分子间特异性的相互作用对目标分子进行快速检测的方法，可实现对单一样品中多种待测物的同时检测，主要包括免疫芯片法、基因芯片法、细胞芯片法等[32]。 LI 等[33]采用可视化微阵列技术开发出了一种同时检测牛奶中三聚氰胺、头孢氨苄和黄曲霉毒素M1的多残留检测技术，检测限分别为16.31、 8.21、 0.21 ng/mL。 LAN 等[34]研发了一种可同时检测7 种农药（三唑磷、甲基对硫磷、甲氰菊酯、呋喃丹、噻虫啉、百菌清和多菌灵）的生物芯片，检测限为0.02～6.45 ng/mL。赵颖等[35]建立了一种可同时检测农产品中毒死蜱等10 种农药多残留的免疫芯片方法，检测限可达1.49～15.72 μg/L，检测过程仅需1.5 h，具有良好的实用价值。由于生物芯片法具有高通量、高效率的特性，已成为一种很有前景的农产品中危害物质残留检测的工具[18]。然而，受限于生物芯片的制备工艺，在样品检测分析中较难获得对不同待测物的良好灵敏度，且易于与其他类似物质发生交叉反应，因此在实际应用中尚未得到广泛应用。

三、生物传感器技术

根据国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）的定义，生物传感器是指能够将生物体内分离的酶、组织、免疫系统、细胞等介导的生化反应转化为电、热或光信号，并通过信号的变化来检测目标化合物的设备[36]。生物传感器分为生物识别和信号转导两部分，根据信号转导方式的不同，可分为光学生物传感器、化学生物传感器、机械生物传感器等[2]。使用生物传感器进行农产品质量安全检测，样品不需要进行复杂前处理，灵敏度高、选择性好，适用于农药残留、兽药残留及微生物的现场快速检测。 STEVENSON 等[37]开发了一种用于检测肉类样品中头孢噻呋残留的电化学生物传感器方法，可以在15 min 内完成检测，在火鸡肉样品中的检测限为10 ng/mL。

近年来，随着多种新型生物识别元件和转导技术在生物传感器开发中的应用，使得生物传感器性能不断提高，逐渐向小型化、便携化方向发展。其中，基于纳米技术开发的生物传感器的研究最为广泛，在提高检测可靠性和灵敏度方面发挥着重要作用[38～39]。 JIN 等[40]研究制备了一种基于超顺磁性纳米颗粒的生物传感器，并将其应用于牛奶样品中的沙门氏菌检测，可在2 h 内准确检测到低至104CFU/mL 的沙门氏菌。 LIN 等[41]报道了一种基于碳纳米颗粒的适配体生物传感器，具有超灵敏和高选择特性，用于牛奶中卡那霉素残留的快速检测，检测限均＜5.0×10－8ng/mL。 MA 等[42]合成了铂纳米粒子锚定锆基金属有机骨架的纳米复合材料，并基于此制备了用于蔬菜水果中有机磷农药残留检测的乙酰胆碱酯酶生物传感器，其检测马拉硫磷的检测限为4.9×10－15mol/L。此外，基于适配体的生物传感器的设计，也为实现农产品中污染物的现场快速检测提供了一种有应用前景的手段[43～44]。

尽管有多种不同方法的融合为生物传感器领域带来了新的机遇，但由于农产品样品本身的基质复杂性，一定程度上阻碍了其向更高特异性和灵敏度方向的发展，还需要进一步研究以提高该技术的性能，以克服实际应用中的挑战[45]。

四、聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应（Polymerase chain reactions，PCR）技术是一种可对特定基因片段进行放大扩增的分子生物学技术，具有灵敏度高、特异性强等优点。近年来，随着多学科交叉研究的发展，以PCR 技术及其衍生技术为代表的分子生物学技术，逐渐被应用于农产品质量安全快速检测领域，特别是用于品种溯源、真伪鉴别、转基因检测、病原微生物测定等方面[46～51]。

常用的PCR 技术主要包括直接PCR、多重PCR （Multiplex PCR）、重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）、实时荧光定量PCR （Real-time fluorogenic quantitative PCR，RT－PCR）、环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等[52～55]。其中，应用最为广泛的为RT－PCR。相较于传统的直接PCR，RT－PCR 不需要进行凝胶电泳等后续分析过程，而是依靠荧光信号实时监测扩增子拷贝数的增加，从而达到实时检测的目的[54]。 TAN 等[46]建立了一种SYBR Green 定量聚合酶链式反应方法，用于肉制品中猪肉掺假的快速检测。该方法以家猪基因组中特异性的重复LINE－1 基因为目标片段，同时改进了基因组DNA 的提取效率，并验证了方法的特异性、灵敏度（0.001%w/w）和稳健性。 WAN等[48]利用绿色饱和荧光染料构建了两种快速检测沙门氏菌的RT－PCR 体系，并采用石墨烯量子点作为放大系统，以增强方法的特异性。通过实际样品验证，该方法阳性检出率更高，所需时间更短，适用于即食水果和蔬菜中沙门氏菌的检测。 LI 等[51]开发了一种针对IE034 转基因玉米的RT－PCR 定量检测方法，根据插入序列与玉米侧翼基因组序列的5' 端连接，设计了134 bp 的扩增子。通过实际样本检测验证，该方法适用于植物源性农产品中IE034 转基因成分的特征识别、风险评估及有效监测。我国也已出台多项国家标准及行业标准，对于RT－PCR 方法的特异性、准确性予以肯定[56～58]。

尽管PCR 技术在农产品质量安全快速检测领域发展较为迅速，但由于方法本身存在的局限性（如易出现假阳性、仪器成本较高等），在实际应用中仍存在较多需要解决的问题。随着仪器和材料技术的不断改进，将PCR 技术与新型材料（如量子点、纳米颗粒等）相结合以进一步提高检测的灵敏度、降低检测成本，可作为未来发展的方向。

五、展望

基于不同生物技术开发的农产品质量安全快速检测方法种类较多，且优缺点各异。应用于实际检测工作时，可根据不同的检测样品及检测需求选择合适的方法及相关产品。

随着快速检测在食品安全监管系统中所占比重逐渐增大，对于快速检测技术及相关仪器、产品的要求也逐渐提高。然而，目前的快速检测方法多为定性或半定量分析，如何在准确定量分析方面有所突破，将是科研人员未来的研究重点。此外，目前市售的快速检测产品，尚无统一的评价标准。国家市场监督管理总局于2021年4月发布了 “关于公开征求《关于规范食品快速检测使用的意见（征求意见稿）》意见的公告”，以期规范食品快速检测的使用。刘海虹等[59]在借鉴国内外相关的检测方法和产品评价技术的基础上，研究制定了食品快速检测产品评价技术规范，并在广东省进行了应用验证，为建立符合我国实际情况的食品快速检测产品评价体系积累了经验；罗俊霞等[60]分别以“ELISA 快速检测”“胶体金ICA 快速检测”和“酶抑制－比色法快速检测” 3 类试剂盒为例，根据其各自的特征和检测目的，初步探索和研究了不同的快速检测试剂盒评价方法，对我国农产品质量安全检测试剂盒的评价工作起到了一定的参考作用。

综上所述，无论是更加准确、灵敏的快速检测技术方法的研发，还是快速检测产品评价体系的建立，都将是今后农产品质量安全快速检测领域发展的方向。