cfr基因介导的耐利奈唑胺头状葡萄球菌及其同源性研究

房钰良，李宜雷，刘真真，刘艳飞，朱元祺1,*

(1.青岛大学医学部 检验系，山东 青岛266071；2.青岛大学附属医院，山东 青岛266003；3.山东省日照市人民医院，山东 日照276826)

头状葡萄球菌属于条件致病菌，在自然界中分布广泛，可引起皮肤软组织、心内膜炎和血流等感染[1-2]。利奈唑胺为恶唑烷酮类抗菌药物，自2000年上市以来，国内外陆续报道以凝固酶阴性葡萄球菌为主的利奈唑胺耐药株[3-4]。头状葡萄球菌对利奈唑胺的耐药机制有多种。其中，cfr基因(chloramphenicol-florfenicolresistance,氯霉素-氟甲砜霉素耐药基因)编码的甲基转移酶介导的耐药越来越引起临床的重视，因为该基因常常位于可移动质粒上，从而使头状葡萄球菌通过接受外来的耐药质粒而获得耐药性[5]。此外，另一个位于质粒上的耐药optrA基因(编码ATP结合盒转运蛋白)也介导利奈唑胺耐药[3]。到目前为止，关于ICU患者分离的耐利奈唑胺的头状葡萄球菌的报道相对较少。因此，本文对2018年6月-2019年10月分离自某医院ICU患者血液标本的耐利奈唑胺头状葡萄球菌进行cfr基因和optrA基因检测，并对这些菌株之间的同源性进行研究，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验菌株收集的利奈唑胺耐药头状葡萄球菌是2018年6月-2019年10月分离自某医院ICU患者的血液标本，共9株，分离自9位患者。沙门菌H9812作为脉冲场电泳分子量标记菌，金黄色葡萄球菌ATCC29213为仪器药敏质控菌株，均为本实验室保存。cfr和optrA基因阳性对照的松鼠葡萄球菌由中国农业大学樊老师惠赠。

1.2 仪器与试剂VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统(生物梅里埃公司)。药敏卡为GP67(梅里埃)，结果判定依据CLSI-2019标准[6]。脉冲场电泳系统CHEF-DR II和凝胶成像ChemiDoc XRS(美国BIO-RAD公司)。其他试剂为宝生物(Takara)公司。

1.3cfr和optrA基因的扩增和测序cfr基因(编码甲基转移酶)和optrA基因(编码ATP结合盒转运蛋白)的扩增依据参考文献进行[5，7]。目的基因的PCR引物合成及扩增产物片段的测序为生工(上海)生物工程有限公司。

1.4 菌株的Sma I酶切头状葡萄球菌基因组脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳具体操作参照文献改良[8]。电泳参数：电压6 V/cm,夹角120°，转角时间，初始转角4 s，终末转角40 s，电泳时间19 h。结果判定依据Tenover规则[9]。

1.5 菌株的高通量测序基于二代Illumina和三代Nanopore测序平台对代表性头状葡萄球菌QD40株进行测序。然后，对获得的细菌基因组和质粒序列利用ResFinder等一系列软件分析菌株的生物信息。

2 结果

2.1 菌株的药敏和耐药基因的扩增和测序结果

9株头状葡萄球菌分离株(QD31-QD37,QD40和QD41)的头孢西丁筛选实验都是阳性，并对青霉素、苯唑西林、红霉素、克林霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和利奈唑胺耐药，但对万古霉素、替加环素和利福平敏感，详见表1。

PCR扩增和产物测序显示这9株头状葡萄球菌都携带cfr基因，但未检测到optrA基因。cfr基因的PCR扩增电泳结果见图1。

表1 头状葡萄球菌临床株的药敏结果(μg/mL)

图1 PCR扩增头状葡萄球菌cfr基因的产物电泳图

2.2 Sma I酶切头状葡萄球菌基因组脉冲场凝胶电泳

Sma I酶切脉冲场凝胶电泳显示9株头状葡萄球菌的电泳条带位置大小和数目完全相同。依据Tenover规则[9]，这9株头状葡萄球菌属于相同的基因型，是相同的菌株(Indistinguishable)，即暴发菌株，表明在ICU患者间存在同一克隆的流行播散。9株头状葡萄球菌的脉冲场凝胶电泳结果见图2。

2.3 菌株的高通量测序结果

基于高通量测序平台，获得了头状葡萄球菌QD40株的染色质(命名为QD40-chr)和携带的3个质粒(分别命名为pQD40-1 ，pQD40-2和pQD40-3)的全序列。经软件分析显示：染色质QD40-chr携带了erm(A),aac(6′)-aph(2″),aadD,ant(9)-Ia和mecA耐药基因；头状葡萄球菌QD40株携带3个质粒，其中质粒pQD40-3大小为39 504 bp，携带了cfr基因。菌株的高通量测序分析结果详见表2。

3 讨论

随着利奈唑胺在临床感染治疗中的应用，对利奈唑胺耐药病原菌的报道越来越多，并以凝固酶阴性葡萄球菌为主[1,3]。对利奈唑胺耐药的机制为：①23S rRNA V区基因突变；②核糖体蛋白L3和L4突变；③甲基转移酶(由cfr基因编码)介导的耐药;④ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC,由optrA基因编码)介导的耐药[10]。

图2 Sma I酶切头状葡萄球菌基因组脉冲场凝胶电泳

表2 头状葡萄球菌QD40株的染色质和携带质粒的生物信息分析

本研究中，9株头状葡萄球菌经PCR扩增和产物测序显示都携带cfr基因，而且高通量测序进一步验证在头状葡萄球菌QD40中，该基因位于大小为39 504bp的质粒pQD40-3上，而且该质粒同时携带aac(6′)-aph(2″)基因。另外，在头状葡萄球菌QD40中，染色质QD40-chr上携带了erm(A)、 aac(6′)-aph(2″)、 aadD、ant(9)-Ia和mecA耐药基因，而质粒pQD40-1和pQD40-2分别携带qacA基因和blaZ基因。此外，这些菌株的药敏实验显示头孢西丁筛选实验阳性，并对青霉素、苯唑西林、大环内酯类和喹诺酮类耐药。以上结果表明，这9株头状葡萄球菌的耐药表型与基因型相一致，即菌株呈现的多重耐药表型与其携带的耐药基因相符合。

来自牛体内的松鼠葡萄球菌分离株携带的cfr基因是2000年由Schwarz首先报道[11]。而位于肠球菌属质粒上的optrA基因最初是Wang等[7]于2015年报道。由于cfr基因和optrA基因常常位于质粒上，使病原菌容易获得性耐药，并导致医院感染的流行或暴发[10]。依据Tenover规则[9]，本研究的9株头状葡萄球菌有相同的PFGE图，提示这些菌属于相同的基因型，是相同的菌株(Indistinguishable)，即暴发菌株，这表明在ICU患者之间存在相同克隆的暴发流行。此外，不同种的葡萄球菌也可对利奈唑胺耐药，也可引起医院感染暴发。如，García报道了由利奈唑胺耐药的金黄色葡萄球菌引起的ICU患者之间的医院感染暴发流行[12]，而Kelly则报道由利奈唑胺耐药的表皮葡萄球菌在ICU导致的克隆暴发[13]。因此，质粒携带cfr基因的葡萄球菌容易在住院患者之间传播，引起医院感染暴发流行，这应引起临床重视。

有研究表明，细菌对利奈唑胺耐药与长期使用该药引发选择性压力下的耐药有关[10]。通过回顾性分析9株头状葡萄球菌分离株来源患者的临床资料，发现这些患者都曾经接受利奈唑胺的抗感染治疗。与我们研究相同的是，Yang于2013年报道[14]在两所医院出现携带cfr基因的对利奈唑胺耐药凝固酶阴性葡萄球菌，也是因为这些患者接受了利奈唑胺的治疗。同样，杨洋于2017年也报道2例患者在使用利奈唑胺治疗2 周期间出现了头状葡萄球菌耐药株[15]。因此，临床在使用利奈唑胺治疗时，需要谨慎延长治疗时间并要动态监测菌株的耐药性。

optrA基因编码的ATP结合盒转运蛋白可介导噁唑烷酮类耐药或MIC升高[7，10]。有研究显示，optrA基因可以在肠球菌属之间传递，甚至在体外实验中可以传递到金黄色葡萄球菌，但是，关于葡萄球菌临床株携带oprtA基因的报道非常少。在本研究中，也未发现这9株头状葡萄球菌携带optrA基因。

总之，携带cfr基因的头状葡萄球菌容易引起医院感染的暴发流行，在临床抗感染治疗时尤其要注意利奈唑胺使用的疗程，并要动态监测耐药性的发展。