基于烟草水提物的Maillard 反应产物影响因素

徐秀娟，茅中一，杨春强，伊勇涛，周培琛，胡 军，谢金栋，史清照*，张 峰*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建省厦门市集美区滨水路298 号 361021

Maillard反应能生成与食品香味、色泽等相关的羧酸类、酮类、吡喃类、吡嗪类、吡咯类和吡啶类等化合物，以及类黑精等大分子物质［1-3］。由于Maillard反应在烟叶的调制、陈化、加工和燃吸期间均会发生，是烟草特征香味形成的主要来源之一，因而Maillard 反应在烟草增香方面的应用研究受到广泛关注［4-6］。采用特定氨基酸与糖的模型体系制备烟用香料以改善烟草制品的感官品质已有较多文献报道［7-11］，但存在香气单一、与卷烟协调性略差等问题。为提高天然香料在卷烟加料中的作用效果，以天然植物提取物为糖源或氮源，通过Maillard反应制备烟用香料的方法逐渐涌现［12-15］。烟草中还原糖质量分数较高，利用烟草自身的还原糖与氨基酸进行Maillard反应制备烟用香料，可达到提高不适用烟叶的利用率、提高烟叶使用价值的目的。然而，目前的报道多以不同反应条件下反应产物的感官作用差异为主，而对反应产物中香韵特征成分的关键影响因素，及其与卷烟感官作用的相关关系研究较少。因此，为充分利用烟叶资源，以亚临界萃取后烟叶残渣制备的烟草水提物为糖源，系统考察了不同氨基酸、糖/氨基酸摩尔比和反应时间等对反应产物中18 种特征香味成分质量分数的影响，旨在为Maillard反应产物的定向控制提供参考，同时为烟叶的综合利用提供技术思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

福建尤溪YLC02-2016 片烟由福建中烟工业有限责任公司提供。

L-谷氨酸（99%）、L-天门冬氨酸（99%）、L-脯氨酸（99%）、糠醛（≥99.5%）、3-甲基-1，2-环戊二酮（98%）、2，5-二甲酰基呋喃（＞98%）和5-羟甲基糠醛（＞99%）［阿拉丁试剂（中国）有限责任公司］；丙酸苏合香酯（98%，内标）、5-乙酰氧基甲基-2-糠醛（＞98%）（美国Acros Organics 公司）；2-甲基四氢呋喃-3-酮（98%）、5-甲基糠醛（99%）和4-环戊烯-1，3-二酮（95%）（美国Sigma-Aldrich公司）；3-羟基-2-丁酮（＞98%）和3-乙酰基吡啶（＞98%）［梯希爱（上海）化成工业发展有限公司］；羟基丙酮（95%）（北京百灵威科技有限公司）；N-甲基-2-吡咯甲醛（98%）（美国Alfa Aesar公司）；糠醇（98%）和2-乙酰基吡咯（98%）（上海安耐吉化学有限公司）；2（5H）-呋喃酮（97%）、4-羟基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（97%）（美国Ark Pharm公司）。

7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；CP224S 型电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）；HY-5型振荡器（金坛市中大仪器厂）；尼龙66 滤膜（0.22 μm，天津津腾公司）；一次性使用无菌注射器（1 mL，河南曙光健士医疗器械集团有限公司）；Easymax 102 合成反应器（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 烟草水提物的制备

将烟叶粉碎后，采用亚临界萃取法进行一级萃取（溶剂为二甲醚，夹带剂为95%乙醇，m二甲醚∶m乙醇=1∶0.05，m烟叶∶m二甲醚=1∶20，萃取时间为20 min，萃取3次），萃取后的烟叶以水为溶剂进行二级萃取（m烟叶∶m二甲醚=1∶10，加热温度为60 ℃，萃取时间为3 h，萃取2 次）。萃取结束后，合并两次萃取液，在体系压力0.01 MPa、水浴35 ℃条件下浓缩至折光指数（20 ℃）为1.427 8，相对密度（20 ℃）为1.243 0。

1.2.2 Maillard反应产物的制备

称取10 g 烟草水提物和适量氨基酸，转移至玻璃反应管中，搅拌速度为800 r/min，在物料温度为110 ℃条件下反应一定时间。反应结束后，将反应液冷却至室温，然后加入5 g水，搅拌均匀，抽滤除去不溶物，收集滤液。氨基酸种类及用量、反应时间等条件见表1。

表1 烟草水提物的Maillard反应条件Tab.1 Maillard reaction conditions for aqueous extracts of tobacco

1.2.3 还原糖、总糖质量分数的测定

借鉴YC/T 159—2002［16］的方法测定样品中还原糖和总糖的质量分数。称取0.20 g样品，加入30 mL萃取剂，室温振荡15 min，经尼龙66 滤膜过滤后进样分析。

1.2.4 Maillard反应产物成分分析

定性及定量分析：分别称量0.50 g 样品，加入5 mL 含内标（10.296 μg/mL 丙酸苏合香酯）的二氯甲烷萃取剂，室温振荡50 min，将萃取液干燥、过滤后进行GC-MS分析。每个样品测定2次，取平均值。

加标回收率：分别称量0.50 g 样品，加入5 mL含内标（10.296 μg/mL丙酸苏合香酯）的二氯甲烷萃取剂及一定量的混标溶液，使待测物浓度分别为样品中浓度的0.5、1.0 和2.0 倍，室温振荡3 h，将萃取液干燥、过滤后进行GC-MS分析。每个样品测定2次，取平均值。

GC-MS分析条件：

色谱柱：DB-WAXetr毛细管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；载气：高纯氦气，流速1.0 mL/min；进样量：1 μL；分流比：10∶1；程序升温电离方式：EI；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；电子倍增器电压：1.89 kV；质量扫描范围：33～500 amu；扫描方式：选择离子扫描，根据保留时间划分时间段。待测物保留时间（Retention time，RT）、定性及定量离子的参数选择见表2。

表2 待测化合物和内标的保留时间和选择离子Tab.2 Retention time and selected ions for the analytes and internal standard

1.2.5 感官评价

参考《烟用香料在卷烟中作用评价方法》［17］和《中式卷烟风格感官评价方法》［18］进行感官评价，以感知标示量值标度法进行赋值［19］。挑选质量为（0.815±0.02）g、吸阻为（1 100±100）Pa 的“七匹狼”空白卷烟样品，将0#～11#Maillard反应产物分别稀释至质量分数为10%（溶剂为水），用自动加香注射机注射于空白卷烟中，注射量1 μL/支，开始和结束注射点距烟丝端分别为5和55 mm。注射完毕后，将卷烟装入烟盒中，密封于温度（22±2）℃、相对湿度（60±5）%条件下平衡1 周。由7 位已取得卷烟感官评吸资格证书的专业人员分别从香气和丰浓等品质特征，酸味、甜味和苦味等味觉特征，以及干草香、木香、辛香和焦香等风格特征等方面对加香效果进行评价。

1.2.6 相关分析

采用SPSS 18.0软件对Maillard反应产物和卷烟感官指标进行简单相关分析，P＜0.05 为显著相关，P＜0.01为极显著相关。

2 结果与讨论

2.1 Maillard反应产物定量分析方法学验证

对2#反应产物进行定性分析，从中共筛选出21种Maillard反应产物，其中能购得标准品的共17种；2-羟基-3-戊酮、2-呋喃基羟基甲基酮、6-乙基-5，6-二氢-2H-吡喃-2-酮和2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮无标准品，因而这4种成分采用内标峰面积比进行定量。待测物的线性方程、相关系数、检测限、定量限、RSD和加标回收率见表3。相关系数范围为0.995 6～0.999 9，检测限和定量限分别为9.39～1 436.45 和31.30～4 788.17 μg/kg，RSD 为0.75%～9.81%，加标回收率为90.00%～111.64%。该方法灵敏度较高，精密度较好，可满足实验要求。

表3 待测物的线性方程、相关系数、检测限、定量限、RSD和加标回收率（n=10）Tab.3 Linear equations， correlation coefficients， limits of detection， limits of quantification， RSDs and spiked recoveries of the analytes（n=10）

2.2 氨基酸种类对Maillard反应产物的影响

由于烟草水提物中含有大量的还原糖，以及少量的含氮化合物，其自身也可发生Maillard 反应，因而以烟草水提物自身的Maillard 反应为空白样品（0#），对比添加氨基酸后反应产物质量分数的变化。21 种香味成分中，N-甲基-2-吡咯甲醛、4-环戊烯-1，3-二酮和5-乙酰氧基甲基-2-糠醛的质量分数不随反应条件的改变而发生变化，表明这3种成分与Maillard 反应过程无关，而是水提物自身的香味成分，因而后续不再详细探讨。

水提物自身的Maillard反应产物中18种待测物的总质量分数为1 319.85 μg/g，其中5-羟甲基糠醛的质量分数最高，占总量的70.50%；其次为羟基丙酮、糠醇、2-乙酰基吡咯；质量分数最低的为2-羟基-3-戊酮和2-呋喃基羟基甲基酮。由于水提物中含N化合物的质量分数较低，因而Maillard反应程度较弱，其还原糖质量分数仅从147.41 mg/g 降低至138.68 mg/g（图1）。

图1 不同反应条件Maillard反应产物中还原糖和总糖的质量分数（图1b中氨基酸为谷氨酸）Fig.1 Mass fractions of reducing sugars and total sugars in Maillard reaction products under different reaction conditions（the amino acid in Fig.1b is glutamic acid）

还原糖与氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸）以1∶1的摩尔比进行反应，考察氨基酸种类对反应产物的影响，结果见表4。可知，当氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸时，反应产物中香味成分总量均较0#空白样品明显提高，而脯氨酸却有降低的趋势，主要是由5-羟甲基糠醛的质量分数降低引起的。Maillard 反应体系中5-羟甲基糠醛的净含量是其生成和降解共同作用的结果，氨基酸与葡萄糖经过一系列反应产生脱氧葡萄糖醛酮，进而转化为5-羟甲基糠醛，随反应程度的加深，5-羟甲基糠醛又可与残余的氨基酸反应，从而降低其质量分数［20-21］。以谷氨酸或天冬氨酸为氮源时，反应产物均以5-羟甲基糠醛为主，其次为羟基丙酮、2-乙酰基吡咯，质量分数最低的为2-羟基-3-戊酮和2-呋喃基羟基甲基酮，这一特征与0#样品相似。不同之处在于，部分物质的质量分数差异较大，例如2-羟基-3-戊酮在谷氨酸体系（1#）中仅为0.25 μg/g，而当氨基酸为天冬氨酸（2#）时，质量分数为1#的14.88倍；2#中糠醇、2-乙酰基吡咯的质量分数均明显高于1#。以脯氨酸为氮源时，反应产物以羟基丙酮、糠醇和5-羟甲基糠醛为主，其次为3-甲基-1，2-环戊二酮、2-乙酰基吡咯、4-羟基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮和2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮。其中，糠醇的质量分数较天冬氨酸和谷氨酸反应体系明显提升，分别是1#和2#的54.77 和 13.82 倍，3-甲基-1，2-环戊二酮是 1#的 5.48倍，2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮的质量分数从 10.53 μg/g（2#）增加至 60.33 μg/g（3#）。然而，2，5-二甲酰基呋喃在3#中未检出。从反应程度上看，3种反应产物中还原糖的质量分数均显著降低，反应程度从高到低依次为2#、1#和3#。这一实验结果表明，在相同的反应条件下，氨基酸不同时，反应程度稍有不同，但反应产物的组成及质量分数差异较大。当氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸时，反应产物的组成与烟草水提物自身的Maillard 反应产物相似，但质量分数有所提高；当氨基酸为脯氨酸时，反应产物的组成与其他两者差异较大。

表4 不同氨基酸种类Maillard反应产物的定量分析结果Tab.4 Quantitative analysis results of Maillard reaction products of different amino acids

通过感官作用评价，考察不同种类氨基酸Maillard 反应产物的感官作用差异（表5）。结果表明，当氨基酸为谷氨酸（1#）时，烟气香气质、香气量均较空白（0#）明显改善，烟气浓度增强，口腔刺激性降低，烟气细腻柔和，烘焙香和甜香明显增强；当氨基酸为天冬氨酸（2#）时，对烟气香气量的改善最明显，但烟气细腻程度和透发性略低于1#，烘焙香高于1#，而甜香降低；当氨基酸为脯氨酸（3#）时，烘焙香浓郁，但烟气状态较散，特点不突出。综合考虑，1#对香气质、香气量均有明显改善，且烟气细腻柔和，刺激性小，甜香明显。因而，在后续研究中以谷氨酸为研究对象。

表5 Maillard反应产物在参比卷烟上的感官评价结果（得分）①Tab.5 Scores of sensory evaluation of Maillard reaction products in reference cigarette

2.3 氨基酸用量对Maillard反应产物的影响

随谷氨酸用量的增加，反应程度逐渐增强，待测物总量呈先增加后降低的趋势（表6）。当还原糖（以葡萄糖计）与谷氨酸的摩尔比（n还原糖∶n谷氨酸）为1∶0.5时，待测物的总量最高；当摩尔比增加至1∶2 时，待测物的总量显著降低，这可能与反应过程中大分子类黑精的生成有关。从成分上看，5-羟甲基糠醛在1∶0.5 的条件下质量分数最高，氨基酸用量的增加反而使其质量分数下降。与此类似的还有2-乙酰基吡咯、糠醛、羟基丙酮等。4-羟基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮略低于0#，且几乎不随谷氨酸用量的变化而改变（20.72～22.76 μg/g）。由表4 可见，该成分主要是由脯氨酸的存在引起的，因而当氨基酸为谷氨酸时，不额外产生该物质。这一结果与文献［11］的报道相吻合。2-乙酰基呋喃随谷氨酸用量的增加而增加，最高质量分数为30.79 μg/g，最低为5.99 μg/g。当氨基酸用量最低时，2，5-二甲酰基呋喃的质量分数最高（41.75 μg/g），随氨基酸用量的增加逐渐降低至6.35 μg/g。由此可见，通过调控氨基酸用量，可以改变Maillard反应产物中各成分的质量分数，进而影响其在卷烟中的感官作用。

表6 不同还原糖与谷氨酸摩尔比Maillard反应产物的定量分析结果Tab.6 Quantitative analysis results of Maillard reaction products at different mole ratios of reduced sugar to glutamic acid

感官评价结果表明，当谷氨酸的用量较低时，卷烟品质特征改善程度较弱，口腔残留和刺激性明显；用量过高则会导致香气质和香气量下降，刺激残留明显，烘焙香和甜香均降低。当还原糖与谷氨酸的摩尔比为1∶1或1∶0.5时，香气质、香气量均有明显改善，烟气浓度增加，透发性变好，烘焙香和甜香均明显增强。综合考虑，最佳反应摩尔比选取1∶0.5。

2.4 反应时间对Maillard反应产物的影响

随反应时间的延长，Maillard反应产物的总量先增加后降低（表7）。当反应时间为2 h 时，质量分数最高。此时还原糖的质量分数为73.93 mg/g，将反应时间延长至3 h 时，反应程度虽有加深，但反应产物的质量分数略降低。从待测物的质量分数来看，大多数化合物随反应时间的延长，其质量分数先增加后降低，而3-乙酰基吡啶的质量分数随反应时间的延长而下降。由表4 可知，3-乙酰基吡啶与脯氨酸的相关性强，因而其质量分数的降低可能与烟草水提物中少量的脯氨酸无法与还原糖发生反应有关。

表7 不同反应时间Maillard反应产物定量分析结果Tab.7 Quantitative analysis results of Maillard reaction products with different reaction time

感官评价结果表明，反应时间过长烟气杂气增加，口腔刺激和残留程度加深，香气质、香气量改善程度较弱，透发性有改善，甜香和烘焙香有不同程度增强。当反应时间为2 h 时，香气质较0#略有改善，香气量显著增强，烟气浓度和透发性改善明显，杂气降低；在风格特征方面，烘焙香和甜香显著增强。综合考虑品质特征和风格特征的改善情况，最佳反应时间选择2 h。

2.5 Maillard反应产物与反应条件的依赖性关系

将极差与平均值之比作为极差系数，对Maillard反应产物中的18种化合物与反应条件的依赖关系进行探讨，结果见表8。极差/平均值的数值越大，说明数据的离散度越高，即该化合物随该反应条件的变化，其质量分数变化较大；反之亦然。与氨基酸用量依赖性较强的化合物有2-乙酰基呋喃、糠醇、2，5-二甲酰基呋喃、2-呋喃基羟基甲基酮和5-羟甲基糠醛；与反应时间依赖性较强的化合物为2-甲基四氢呋喃-3-酮、5-甲基糠醛、3-乙酰基吡啶、2-呋喃基羟基甲基酮和2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮；其中2-呋喃基羟基甲基酮受氨基酸用量和反应时间的影响均较大。这一结果可为Maillard反应产物的可控制备提供依据。

表8 待测物与反应条件的依赖性关系Tab.8 Dependence of target analytes on reaction conditions

表8（续）

2.6 Maillard 反应产物与卷烟感官指标的相关性分析

采用简单相关分析方法对Maillard 反应产物与卷烟感官指标之间的相关性关系进行研究，结果见表9。与浓度相关关系密切的是2-甲基四氢呋喃-3-酮；与透发性关系密切的化合物有糠醛、5-甲基糠醛、2-呋喃基羟基甲基酮和5-羟甲基糠醛，其中5-甲基糠醛为极显著相关关系；与烘焙香相关关系密切的化合物为羟基丙酮和3-甲基-1，2-环戊二酮；6-乙基-5，6-二氢-2H-吡喃-2-酮与柔和呈显著负相关关系。18种待测物与其他感官指标（香气质、香气量、杂气、细腻、刺激、残留、清香、膏香和甜香）不存在显著相关性。

表9 Maillard反应产物与卷烟感官指标的相关性关系①Tab.9 Correlations between Maillard reaction products and cigarette sensory indexes

3 结论

①氨基酸种类直接影响Maillard 反应产物中致香成分的组成，当氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸时，反应产物中的致香成分以5-羟甲基糠醛为主，其次为羟基丙酮、2-乙酰基吡咯；当氨基酸为脯氨酸时，反应产物中的致香成分以羟基丙酮、糠醇和5-羟甲基糠醛为主。②以感官作用结果为依据，基于烟草水提物的Maillard反应最佳反应条件：还原糖与谷氨酸的摩尔比（n还原糖∶n谷氨酸）=1∶0.5、反应温度110 ℃、反应时间2 h。③Maillard反应产物与卷烟感官作用相关性结果表明，与烟气浓度相关关系密切的化合物为2-甲基四氢呋喃-3-酮，与透发性关系密切的化合物有糠醛、5-甲基糠醛、2-呋喃基羟基甲基酮和5-羟甲基糠醛，与烘焙香相关关系密切的化合物为羟基丙酮和3-甲基-1，2-环戊二酮。在制备Maillard 反应产物时，适当提高上述化合物的质量分数，有利于卷烟感官质量的提升。