粉垄耕作对甘蔗土壤微生物群落的影响

刘洪 韦本辉 党柯柯 彭俊伟 李建刚 董元华

摘  要：粉壟耕作是一种新型的深耕深松的耕作技术，与常规耕作方式不同，粉垄耕作能增加耕层土壤深度，从而更好地改善土壤结构。为揭示不同耕作方式对甘蔗种植土壤细菌和真菌群落的影响，本研究以粉垄耕作和常规耕作的土壤为研究对象，通过16S rRNA和18S rRNA高通量测序技术分析不同生态位（非根际、根际和根表）土壤的细菌和真菌群落的组成、结构和多样性的变化，并结合土壤理化性质进行相关性关联分析。结果表明：相比于常规耕作处理，粉垄耕作处理后的中小团聚体（<1 mm）比例增加，而较大团聚体（>1 mm）比例则低于常规耕作处理。粉垄耕作处理土壤中的有效磷和有机质含量明显增加，而全氮和全磷含量降低。厚壁菌门和绿弯菌门的相对丰度在粉垄耕作处理中显著增加，并且粉垄耕作处理后的细菌和真菌群落的alpha多样性明显增加，而不同生态位土壤的微生物群落的alpha多样性差别不大。对微生物beta多样性差异而言，粉垄耕作处理的土壤微生物群落结构相比常规耕作发生了明显变化，不同生态位土壤的细菌群落结构差异显著，而不同生态位的真菌群落结构差异不大。结合环境因子的相关性分析可知，全氮、有效磷以及有机质含量的变化能显著影响土壤中微生物特性的变化，并且有效磷和有机质含量的改变是影响土壤微生物群落组成的主要因素。综上，不同的土壤耕作方式处理下甘蔗土壤的养分和团聚体组成发生改变，土壤细菌和真菌群落结构和多样性存在差异，而微生物群落多样性和结构的变化受土壤有效磷和有机质的影响。这些研究结果可为解析甘蔗土壤微生物群落对不同耕作方式的响应机制提供理论依据。

关键词：土壤理化性质;微生物群落;粉垄;高通量测序;耕作方式中图分类号：S34.1;S154.3     文献标识码：A

Effect of Deep Vertical Rotary Tillage on Microbial Community in Sugar Cane Soil

LIU Hong， WEI Benhui， DANG Keke， PENG Junwei， LI Jiangang， DONG Yuanhua

1. Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation， Chinese Academy of Sciences / Institute of Soil Science， Chinese Academy of Sciences， Nanjing， Jiangsu 210008， China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Deep vertically rotary tillage is a new type of deep ploughing and deep loosening farming technology. Different from conventional farming methods， deep vertically rotary tillage could increase the depth of the cultivated layer soil， thereby better improving the soil structure. In order to reveal the influence of different farming methods on the bacterial and fungal communities of sugarcane planting soil， this study took deep vertically rotary tillage farming and conventional farming treated soil as the research object， and analyzed different ecological niches through 16S rRNA and 18S rRNA high-throughput sequencing technologies （bulk soil， rhizosphere， and rhizoplane） soil bacterial and fungal community composition， structure and diversity changes， combined with soil chemical properties to carry out correlation analysis. The results showed that compared with conventional tillage treatments， the proportion of small and medium aggregates （<1 mm） increased after deep vertically rotary tillage treatment and the proportion of larger aggregates （>1 mm） was lower than that of the conventional tillage treatment. The content of available phosphorus and soil organic matter in the soil treated by deep vertically rotary tillage increased significantly， while the content of total nitrogen and total phosphorus decreased. The relative abundance of phyla Firmicutes and Chloroflexi significantly increased after deep vertically rotary tillage treatment， and the alpha diversity of bacterial and fungal communities after deep vertically rotary tillage treatment increased obviously， while there was no significance observed in the microbial alpha diversity among different niches of soils. In terms of the differences in microbial beta diversity， compared with the conventional tillage treatment， the soil microbial community structure in the deep vertically rotary tillage treatment altered significantly. At the same time， the bacterial community structures varied from different niches， while no obvious difference was observed in the fungal community structure among different niches. Combined with the correlation analysis of environmental factors， the changes in total nitrogen， available phosphorus， and organic matter content could significantly affect the soil microbial characteristics， and the available phosphorus and soil organic matter were the main factors affecting the composition of soil microbial communities. In summary， the composition of sugarcane soil nutrients and aggregates altered under different soil tillage treatments， and there were differences in the structure and diversity of soil bacterial and fungal communities. The diversity and structure of microbial communities under different tillage methods were affected by soil available phosphorus and organic matter. These research results can provide a theoretical basis for analyzing the response mechanism of sugarcane soil microbial communities to different tillage methods.

soil chemical properties; microbial community; deep vertically rotary tillage; high-throughput sequencing; tillage methods

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.019

红壤是我国重要的土壤资源，而红壤区域是主要的经济作物产区之一，如作为经济作物之一的甘蔗产量占全国60%以上，在我国经济作物生产中占有重要地位。然而，随着集约化种植、“减肥减药”政策以及经济水平的变化，农业生产上对农产品的产量和品质的要求也不断提高，因此采取更有效的措施对土壤肥力提升具有重大的生产意义。

不同的土壤耕作方式对土壤的影响不同，如20世纪60年代开始实行的免耕，即播种前不进行任何的土壤耕作以期达到保护土壤结构和土壤保肥的效果，但免耕对土壤养分状况的改善效果不明显甚至会导致土壤物理性质变差;而目前常用的常规耕作，即浅旋耕，会导致土壤犁底层上移、耕层土壤变浅、表层土壤板结，进而使得土壤水分渗透能力和通气性能降低，甚至保水保肥能力减弱。因此合理的土壤耕作方式能有效地改善土壤的水、肥、气、热等特性，以提升土壤肥力和土壤健康，从而达到促进作物增加产量与提升品质的目的。作为近几年兴起的耕作方式，粉垄耕作是一种新型的深耕深松的耕作技术（耕作深度能达到50 cm），该技术能增加耕层土壤深度，改善土壤结构，如改变土壤团聚体颗粒大小组成（从大团聚体向中小团聚体转化），以增加土壤的孔隙、降低土壤的容重，改变耕层土壤养分的分布，以提高土壤的保水保肥能力、为作物的生长提供更好的耕层土壤环境，从而提高作物产量和对养分的利用效率。粉垄耕作技术的推广对于一些板结的土壤，尤其是给种植甘蔗地和草原地土壤的改良带来了福音。

粉垄耕作除了能够显著改变耕层土壤的物理性质，促进作物根系的生长发育，增加玉米、小麦、土豆等作物的产量，而且粉垄耕作作为一种土壤扰动方式，也能通过改变土壤结构来间接影响土壤酶活特性和微生物区系等生物学特性，改变土壤微生物群落的组成、结构、功能及其多样性。然而，目前关于粉垄耕作技术的研究主要集中在其对土壤理化性质和作物生长及产量的影响，而其对作物根际土壤中微生物群落结构的影响研究较少，尚不能满足其对实际生产的理论指导要求。因此，研究不同耕作方式下耕层土壤理化性质与微生物群落的变化对于进一步解析耕作机理具有重要意义。

本研究基于一种土壤粉垄耕作技术，以不同土壤耕作方式为研究对象，采用16S rRNA和18S rRNA高通量测序技术分析广西南宁甘蔗种植地的土壤微生物群落的组成、结构和多样性，并结合土壤理化性质进行相关性分析，探究粉垄耕作方式下土壤理化性质驱动微生物群落变化的土壤微生物学机制，以期从微生态的角度为土壤改良在可持续农业中的应用提供理论依据和技术手段。

  材料与方法

试验地概况

本试验在广西壮族自治区南宁市隆安县的那桐镇大滕村（22°99′N， 107°88′E）进行，该试验地位于广西的西南部，为第四纪红土，土壤类型为湿热、铁铝亚纲的赤红壤。气候类型属于南亚热带季风气候，该地区年平均降水量1301 mm，而年内降水量不均匀，具有较强的季节性，降水主要集中于6—9月。该地区年均气温为21.8℃，多年平均最高月气温为28.4℃，平均最低月气温为13.2℃。试验地为平地，无坡度;土地利用方式为甘蔗田。土壤母质为第四纪红土，肥力中等，土壤质地为粉质壤土。

 方法

1.2.1  试验设计与土壤样品的采集  试验分为2个耕作处理，分别为常规旋耕（CK）：采用功率为132 kW拖拉机，耕作土层深度均为20 cm;粉垄（FL）：采用功率为295 kW粉垄机，耕作土层深度均为50 cm。试验于2018年4月进行，耕作在同一天完成，采用间隔重复设计，重复4次，即2个处理（粉垄耕作与常规耕作），每个处理包括4个重复（4个小区），随机排列。每个小区面积90 m（长15 m，宽6 m），每个小区种植11行。供试作物为甘蔗，甘蔗品种为‘桂糖42号’。各处理按照当地常规习惯统一供试肥料用量及种类：复合肥N∶PO∶KO含量均为15%，尿素（含N 46.5%），钾肥为氯化钾（含KO 60.0%）。2个月后采集甘蔗根系及其对应的非根际土，及时分离出根际土和根表土。每个样品由周围5个样混合而成，每个样品包括3个重复，最终收集到2个耕作方式下3种生态位（非根际样品、根际样品以及根表样品）的18个样品（表1）。

1.2.2  土壤理化性质检测  土壤基本理化性质的测定均参考鲁如坤的方法，其中土壤有机质含量采用重铬酸钾氧化法测定;土壤全氮含量采用凯氏定氮法测定;土壤全磷含量先采用氢氟酸-次氯酸消煮，然后用钼蓝比色法测定;土壤有效磷含量先采用0.5 mol/L NaHCO提取，然后用钼蓝比色法测定。土壤团聚体的大小分级采用Elliott土壤团聚体湿筛法测定。

1.2.3  土壤DNA提取與16S rRNA基因扩增子测序  称取0.5 g土壤样品，利用MP土壤DNA提取试剂盒（FastDNA SPIN Kit for Soil， MP Biomedicals， LLC， Solon， OH， USA）并按照说明进行土壤DNA提取，并将成功提取的DNA立即置于–20℃冰箱中保存。

利用特异性引物515F（5′-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3）和907R（5-CCGTCAATTCCTTT GAGTTT-3）对细菌16S rRNA基因的V4-V5可变区进行PCR扩增。利用特异性引物528F（5- GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3）和706R（5-AA TCCRAGAATTTCACCTCT-3）对真核微生物18S rRNA基因的V4区进行PCR扩增。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶检测特异性，根据浓度对PCR产物进行等质量混样。然后利用建库试剂盒TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina， San Diego， CA， USA）构建文库，文库构建成功后，在Illumina MiSeq平台上进行测序。

  数据处理

下机后的原始数据经过FLASH（V1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）拼接，得到原始序列。利用QIIME软件（V1.9.1， http：//qiime. org/scripts/split_libraries_fastq.html）对原始序列进行过滤，过滤后的数据通过Usearch（Version 2.13.2）进行嵌合体的检测与去除，最终得到有效数据。

所有样本的有效数据经过Uparse软件（Uparse v7.0.1001， http：//www.drive5.com/uparse/）将同源相似性大于等于97%的序列聚类为相同的OTUs（operational taxonomic units），筛选出现频次最高的序列作为OTUs的代表序列，并利用SILVA132（http：//www.arb-silva.de/）数据库进行物种注释分析。所有OTUs的系统发育关系通过MUSCLE软件（Version 3.8.31， http：//www. drive5.com/muscle/）构建。最终以测序数据量最小的样本为标准对所有样本的OTU丰度数据进行均一化处理。

基于均一化处理后的OTUs数据信息进行后续分析。使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算丰富度（Richness）、香农指数（Shannon）。用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Bray-Curtis距离，使用R软件（Version 3.6.0）的vegan包和ggplot2包绘制PCoA图和RDA图。利用R软件（Version 3.6.0）对不同处理间微生物群落结构差异性进行Adonis检验。微生物群落结构用β多样性（Bray- Curtis距离）来表征，微生物多样性用alpha多样性中的香农指数表征，它们间的相关性利用Pearson（皮尔森）相关性来展开分析。

土壤理化性质数据采用Microsoft Excel（Version 2016）和SPSS（Version 20.0）软件进行分析，利用SPSS软件中的单因素ANOVA（Duncan’s multiple range test）计算不同处理间的差异显著性，所有图片由R软件（Version 3.6.0）绘制，所有表格由Microsoft Word（Version 2016）绘制。所有数据以平均值±标准误的形式呈现。

  结果与分析

  粉垄处理下土壤理化性质的变化

土壤的理化性质分析显示，经过粉垄处理后的土壤有机质、有效磷含量均显著高于常规耕作（表2），其中有机质和有效磷的含量分别为34.51%和46.33 mg/kg，是常规耕作对应含量的3.11倍和3.09倍;而土壤全氮和全磷含量则显著低于未经粉垄的常规耕作处理。不同耕作方式下的土壤养分差异显著，这可能是粉垄耕作改变了土层，扰动了土壤矿物，使得下层土上翻，并使之释放出养分。而对于团聚体，经过粉垄处理的土壤，其团聚体大小为1 mm的占比高于常规耕作，而1 mm以上的团聚体则低于常规耕作处理（表3）。這表明经过粉垄处理后，大型团聚体被更多地向小型团聚体进行转化，并使得其中全量养分可能更易被微生物转化利用成更利于植物根系吸收利用的有效养分。

  粉垄处理后的微生物多样性和群落结构变化

土壤细菌群落的alpha多样性通过丰富度（Richness）、香农指数（Shannon）来表征。基于土壤细菌的16s rRNA和真菌的18s rRNA高通量测序分析表明，不论是细菌还是真菌，经过粉垄耕作处理后，其香农指数和丰富度指数均明显高于常规耕作，而不同生态位的多样性指数差别不大（表4）。基于OTU水平的主坐标轴分析（PCoA）结果显示，粉垄处理土壤和常规耕作土壤的细菌群落结构差异显著（=0.001， =0.9243），能沿着轴一明显区分（47%），而2种处理下的不同生态位的细菌群落则能沿着轴二明显区分（15.3%）（图1A）;对于真菌，粉垄耕作处理土壤和常规耕作土壤的真菌群落结构差异显著（=0.001， = 0.9218），能沿着轴一明显区分（57%），而不同生态位的真菌群落结构差异不大（图1B）。这表明，粉垄耕作处理后的细菌和真菌的多样性明显提升，微生物群落结构变化显著，而宿主植物在一定程度也能影响细菌群落结构，而对真菌群落结构影响不大。

  粉垄处理后的细菌群落组成的变化

基于16S rRNA高通量测序技术，分析了粉垄耕作处理和常规耕作下的细菌微生物群落组成的变化。在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acido­bacteria）、绿弯菌门（Choloflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）在细菌微生物群落中占主导地位。与常规耕作相比，粉垄耕作处理下的变形菌门的相对丰度明显降低，而绿弯菌门和厚壁菌门的相对丰度明显高于常规耕作（图2）。进一步分析发现，2种耕作方式下，变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度随着离植物根的距离增加而减少，而绿弯菌门（Choloflexi）相对丰度的变化趋势则恰好相反（图3）。

  粉垄处理后土壤理化性质与微生物群落的关系

粉垄处理后的微生物群落与土壤理化性质的相关性分析表明，土壤理化因子中的全磷（TP）与微生物群落的关联较低，微生物特性中，细菌群落多样性对土壤理化因子的响应较弱（>0.05），而全氮（TN）、有效磷（AP）以及有机质（SOM）含量与微生物真菌的多样性、细菌和真菌群落结构，以及变形菌门和绿弯菌门丰度的相关性较强（>0.8， <0.05）（图4），表明全氮、有效磷以及有机质含量的变化能显著影响土壤中微生物特性的变化。而基于Bray-Curtis距离的典型对应分析（RDA）进一步表明，以根际微生物群落和土壤理化性质为例，不论是细菌还是真菌，全氮（TN）、有效磷（AP）和有机质（SOM）含量驱动微生物群落结构的变化（图5）。其中全氮（TP）含量驱动着常规耕作中的细菌和真菌群落结构的变化，而有机质和有效磷含量则是驱动粉垄处理下的细菌和真菌的群落结构的变化，这进一步验证了微生物群落与土壤理化性质的相关性。

  讨论

本研究报道了2种耕作方式下土壤理化性质，以及微生物群落组成、多样性、结构的变化。结果表明不同耕作方式下的团聚体组成存在一定的差异，粉垄处理后的土壤大团聚体更多地向小于1 mm粒径大小的中、小团聚体转化，这主要是由于粉垄处理对土体的扰动强度较大，减少了土壤中的大团聚体，而增加了土壤中的中、小团聚体。BAILEY等发现土壤中较小的团聚体内部存在较多的大孔隙，促使其形成的土壤总孔隙和孔隙表面积较大，从而更有利于作物的根系进行下扎和增加对水分与矿质养分元素的吸收。中小团聚体对养分的存储能力较强，使之更有利于加强作物对土壤养分的吸收，从而对农业生产具有重要意义，因此粉垄耕作处理比传统耕作处理对土壤肥力的利用和保持更具有重要意义。在本文中有效磷和有机质含量在粉垄处理中显著高于常规耕作处理，而总氮与总磷含量则显著低于常规耕作处理，因此，这可能就是土壤总氮、总磷、有效磷和有机质含量在粉垄处理和常规耕作处理间均存在显著差异的原因。

不同的土壤特性对土壤微生物群落组成和多样性均有一定影响。土壤中的有效养分和有机质含量越高，能为土壤提供更多的资源和生态位，从而容纳更多的微生物。在本研究中，粉垄处理明显降低了变形菌门的丰度，而增加了厚壁菌门和绿弯菌门的相对丰度。研究表明，厚壁菌门及其类别包括芽孢杆菌与植物促生作用有关，而绿弯菌则与植物光合作用相关，因此也能在一定程度上促进植物的生长发育。同时对显著变化的微生物与土壤理化性质进行相关性分析可知，绿弯菌门与厚壁菌门和总氮含量显著负相关，而和有效磷与有机质含量呈显著正相关，尤其是绿弯菌门（图4），表明粉垄处理比常规耕作更有利于厚壁菌和绿弯菌的生长繁殖。土壤微生物群落的alpha多样性指数常用来评价微生物群落丰富度和多样性，粉垄处理后的土壤细菌和真菌微生物的多样性明显高于常规耕作处理，尤其是真菌的多样性变化更大。同时结合Pearson相关性分析也表明，甘蔗的根际真菌群落多样性与总氮呈显著负相关，而与有效磷和有机质含量呈显著正相关。说明粉垄耕作处理后的小团聚体的增加使土壤中的孔隙和有效态养分（有效磷和有机质）含量增加，使土壤中可供微生物利用的资源和空间增加，环境容纳量增加，即生态位增多，进而能容纳更多的微生物种类，增加了微生物群落的多样性。

除了土壤微生物組成和多样性，土壤特性差异对土壤微生物群落结构也有重要的影响。本研究中不同耕作方式下的细菌和真菌群落结构明显不同（=0.001），尤其是细菌群落结构。细菌群落结构不仅在不同耕作方式下差异显著，而且在植物的不同生态位（非根际土、根际土以及根表土）也存在显著差异，能沿着轴二区分（图3）。微生物群落结构与理化性质的冗余分析和相关性分析进一步表明，甘蔗根系对细菌群落结构存在一个较强的根系过滤作用，表明有效态养分（有效磷和有机质）驱动粉垄耕作处理过的甘蔗根际细菌和真菌群落结构的变化，而总氮驱动常规耕作处理下的根际细菌和真菌群落结构的变化。说明与常规耕作相比，粉垄耕作可能通过改变环境因子从而引起土壤微生物群落结构的变化。

  结论

综上，粉垄耕作后土壤中的中小团聚体比例增加，土壤可供利用的养分包括有效磷和有机质含量明显提升，甘蔗根际土壤细菌菌群结构组成发生变化，尤其是厚壁菌门和绿弯菌门的相对丰度显著增加，同时甘蔗根际土壤细菌群落的多样性和结构发生改变。土壤环境因子中的有效磷和有机质含量的改变是影响土壤微生物群落组成的主要因素。研究结果可为解析甘蔗土壤微生物群落对不同耕作方式的响应机制提供理论依据。总的来说，粉垄耕作可通过深度扰动土壤结构，使更多有效土壤矿物养分得以释放，进而促使微生物群落的多样性、组成和结构发生改变。

参考文献

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