氨基糖分析检测方法和应用的研究进展

蓝 丽 陈昱锟 谭立清 蒋 雯 刘晗昱 侯向华　

氨基糖分析检测方法和应用的研究进展

蓝 丽1陈昱锟1谭立清1蒋 雯2刘晗昱2侯向华2

（1.中国科技开发院广西分院，广西 南宁 530022；2.广西产研院新型功能材料研究所有限公司，广西 南宁 530000）

氨基糖是一类存在于土壤微生物中及其残留物中的化合物，常作为微生物残留物的生物标识物。文章对土壤中有机质循环、微生物在土壤中的作用进行研究，对氨基糖的检测技术、氨基糖的应用方面的研究进展进行叙述。

氨基糖；检测技术；应用；研究进展

引言

氨基糖是一类糖的羟基由氨基所取代的化合物的总称，是许多生物大分子如壳聚糖、抗生素、脂多糖、糖蛋白和黏多糖等的组成成分[1]。它是来源于微生物并具有较高的稳定性，是土壤微生物细胞壁的组成成分，氨基糖在土壤中的含量较低，且含量占土壤氮含量的比例不足10%[2]，它是土壤活性有机氮非常重要的组成成分，土壤矿物氮也是其主要来源[3]。

在土壤和水环境中，氨基糖是有机碳和有机氮的重要组成成分，在环境的碳氮循环中发挥着重要作用。由于其在不同生物体内的含量和组成结构不同，因此可以根据环境中氨基糖的结构组成来判断有机质的成分[4]。在环境中，含量最丰富的两种氨基糖是葡萄糖胺和半乳糖胺，它们多存在于细菌、藻类、古菌及无脊椎动物体内。此外，胞壁酸是只存在于细菌体内，是细菌细胞壁肽聚糖的主要组成成分之一。而甘露糖胺虽含量较少，且来源性不专一，但却是一种不可忽视的氨基糖。它在藻类及细菌的残留物中较为常见，是膜糖脂中唾液酸的结构骨架。

1　氨基糖分析检测方法研究进展

氨基糖是江河湖泊、土壤及海洋等环境中的一种重要组分。近年来，氨基糖作为生物标识物，在环境科学、生命科学及地球科学等领域备受关注。最早检测氨基糖的方法主要有光度法、电化学法和电泳法[5]等，但这些方法存在很多不足，例如检出限较高、样品杂质对其结果影响较大以及在复杂的环境中检测受限。随着仪器分析技术的发展，气相色谱法、高效液相色谱等分析测试技术以其高灵敏度、检出限低及准确度等优点成为检测氨基糖的主要分析手段。

1.1　Elson-Morgan法

Elson-Morgan法的原理是在一定温度条件下，氨基葡萄糖分子的2号碳原子上的氨基与过量的乙酰丙酮碱性溶液发生乙酰化反应，生成特定的N-乙酰衍生物。然后在酸性条件下，该衍生物与对二甲氨基苯甲醛发生络合反应，生成紫色络合物，在525 nm有最大吸收。该操作方法步骤繁琐，重现性大，影响结果准确性因素较多，且不能特异性区分氨基葡萄糖和氨基半乳糖，只适用于肝素纯品含量的测定[6]。

1.2　离子色谱法

离子色谱法是近年来出现的用来检测糖类的一种新技术。其基本原理是在单糖和寡糖的pH值大于12的情况下，解离离子型物质的阴离子。这种检测方法能明显区分开氨基葡萄糖以及氨基半乳糖。为了对肝素药物质量进行控制，田玉晔[7]利用离子色谱法对肝素中氨基糖的组成结构进行了分析，结果显示，该法的重现性好，灵敏度也高。

1.3　气相色谱法

1984年Barrie 等[8]提出了同位素比例质谱法，首先将经气相色谱分离得到的有机物中的C燃烧生成二氧化碳，以及将N转化为N2之后，在载气的携带下进入同位素质谱仪进行检测。Glaser 等[9]应用这种方法对土壤中的13C进行分析，进而研究微生物残留物的稳定性。这种方法对近天然丰度的化合物检测灵敏度高，但对于待检测同位素化合物丰度较高时，其检测准确性下降，还有可能污染检测器，应用范围受限。

Zhang[10]等提出氢离子火焰检测法，将样品与适量6 mol/L盐酸于水解瓶中，在105℃条件下进行水解8 h，冷却至室温，加入肌醇，振荡摇匀后过滤，将滤液进行真空干燥（残余物溶于一定量蒸馏水中），用0.4 mol/L的KOH调pH值至6.6～6.8，离心，取上清液进行干燥，残渣溶于3 mL无水甲醇，离心，上清液在N2下吹扫干燥，将将残渣溶于1 mL水中，并加入N-甲基氨基葡萄糖，冷冻干燥。然后加入300 μL衍生化试剂，于70℃～80℃条件下加热30 min～35 min，冷却至室温，加入1 mL乙酸酐加热20 min，除去过量衍生化试剂，最后，将衍生物溶于乙酸乙酯—正己烷混合溶剂（v/v=1∶1），进行气相色谱分析。这种方法样品用量少、选择性好、灵敏度高。

氨基糖化合物具有挥发性及热稳定性相对较差、沸点高等特点，氨基糖主要以酰氨基糖的形式存在（如几丁质、肽聚糖）于自然环境中，有研究表明在使用气相色谱-氢火焰离子化检测法检测氨基糖过程中，自然界或微生物培养过程中的氨基糖苷类抗生素很有可能对部分氨基糖的定量造成干扰[11]。

质谱法与其他气相色谱法相比，不同点在于质谱法是利用电子轰击电离源或化学电离源的高能量，将经气相色谱分析后的有机物按一定规律形成离子碎片，利用这些碎片信息对待测物进行定性定量分析[5]。有研究者通过研究表明氨基糖检测化学电离源相对于电子轰击电离源更合适，原因是化学电离源具有产生碎片少、灵敏度高等优点增加了甲烷气体作为电离缓冲介质，高能电子束的能量被吸收后，通过离子作用到样品分子上。这种方法具有高效分离和高灵敏度的优点。质谱法能提供同位素比值和分子结构信息，因此在土壤氨基糖的循环转化研究领域应用尤其广泛。

1.4　高效液相色谱法

高效液相色谱法的原理是以液体为流动相采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后进入检测器进行检测。这种方法具有分离效能高、高灵敏度、分析速度快、分离效能高、应用范围广等优势，适合分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。

高效液相色谱—荧光检测法在氨基酸的检测方面应用较多，而关于氨基糖的研究较少。例如Zelles等[12]利用此方法检测出土壤中的氨基葡萄糖和胞壁酸，而Appuhn等[13]利用此方法实现土壤和根系水解物中四种氨基糖的定量，并实现自动化分析，使该方法更加方便快捷。而此方法之所以未在检测氨基糖方面得到广泛应用，有以下几点原因。首先，氨基糖本身不具有荧光性，氨基糖需要衍生成适合荧光检测器的化合物，而这种化合物又容易分解，操作条件需进行严格控制。其次，其检测过程易受氨基酸的干扰，且中性糖不能与氨基糖同步检测。

高效阴离子交换色谱—安培检测法主要用于糖类及其衍生物的检测。步骤为在100℃条件下，用3 mol/L盐酸水解样品5 h，将水解液分成两份，水解液a用于氨基葡萄糖、氨基半乳糖以及氨基甘露糖的检测，水解液b则用于胞壁酸的检测。水解液a在进行中和之前加入内标物α-1-葡萄糖磷酸二钠盐水合物，最后进行高效阴离子交换色谱—安培检测法分析[5]。这种方法不需要对样品进行衍生处理，无预浓缩过程且不需有机溶剂，因其具有干扰小的优势而被普遍应用。但这种方法也存在很多缺点，例如，胞壁酸的检测与其它三种氨基糖的性质不同，若要实现胞壁酸的高回收率，会大大增加工作量。其次大气中二氧化碳也可能会影响结果的重现性等。

高效液相色谱-同位素比例质谱法大致原理为样品在经过高效液相色谱检测后分离的有机物在液相中在氧化剂中通过高温氧化成二氧化碳，二氧化碳在载气的携带下从液相色谱中脱离出来，然后进入同位素比例质谱仪进行检测。

超高效液相色谱-高分辨率质谱与普通的超高效液相色谱相比，具有系统稳定性更高、重现性好、分离能力强以及更具高通量等优点。Hu等[14]利用此技术实现了对土壤中游离氨基糖的检测分析。但由于该方法技术尚未成熟且成本较高，因此此方法还未普遍应用。

1.5　红外光谱法

红外光谱法被用于样品的定性分析较多，各个物质的含量可根据峰位置、吸收强度也将反映在红外吸收光谱上进行定量分析。此方法具有样品用量少，分析灵敏度高，操作简便，耗时少，成本较低，无危险试剂的使用等特点，该方法应用于定量分析时误差较大，因此被用于定量分析应用少。近几年，有一部分研究学者利用红外光谱法进行氨基糖的分析，Dick等[15]将此法用于氨基糖含量的测定，Zhang等[16]也利用此法对土壤中三种重要氨基糖的浓度进行了预测，并取得一定成果。

红外光谱法检测手段在组分分析方面可以达到微米级或者纳米级的分析，此外二次离子质谱等方法在组分分析方面也具有非常明显的优势。这些分析方法可能在未来被广泛用于氨基糖的分析。

2　氨基糖的应用研究进展

依据目前的研究来看，氨基糖多用于作为生物标识物，土壤氨基糖含量变化对观察微生物固碳及土壤有机质动态变化具有重要意义[17]。而氨基糖在医药以及其它方面的研究相对较少。

2.1　作为生物标识物

氨基糖既是土壤中有机氮库的重要组成部分（土壤中氨基糖态氮占土壤总氮的5%～10%），又是土壤微生物细胞壁残留物质，主要来源于土壤微生物。除此之外，氨基糖还具有较高稳定性和具有明确的微生物来源，因此，研究土壤中氨基糖的积累效应对研究土壤中氮的微生物转化过程的有效途径具有重要意义[18]。因此，学者们大多采用氨基糖作为生物标识物，对土壤中有机质及微生物在土壤中的作用进行研究。李俊娣等[19]同样利用氨基糖作为生物标识物，通过了解真菌和细菌残留物的积累与转化，来探究真菌和细菌在土壤有机质转化中的作用，以此为理论依据，促进土壤养分的增加和微生物多样性的提高，从而改善当地土壤环境。宁赵等[20]同样利用氨基糖作为生物标识物，分析不同施肥处理条件下，从微生物标识物角度考虑微生物在稻田土壤有机碳在积累和转化中的作用，为当地有机物替代肥料的实践提供理论依据。吕慧捷等[21]通过研究不同肥料配施后玉米不同时期的氨基糖含量变化，来推断微生物来源物质的转化迁移特征，对土壤有机质循环和土壤微生物对碳氮的截获有重要意义，也为土壤有机质的循环周转的关键因子的揭示提供重要理论基础。Zhang等[22]研究了土壤氨基糖含量与土壤微生物化学性质之间的联系，来探究微生物残留C和土壤环境因素之间可能存在密切关系。井艳丽等[23]采用氨基糖作为微生物残留物的生物标识物，来探究引入固氮树种对辽东落叶松人工林土壤团聚体氨基糖的影响。王等倩[24]研究长期连作棉田土壤中氨基糖的含量和组成变化，旨在评价棉花长期连作及秸秆还田对土壤有机质转化积累的微生物群落的影响。

2.2　在医药方面的应用

近年来，氨基糖在医药方面的影响日渐显著。有研究学者发明一种氨基糖与金纳米复合材料，这种材料对细菌细胞壁有破坏作用，且利用革兰氏阴性菌和阳性菌细胞壁结构的不同，来抑制革兰氏阳性菌的生长[25]，最终达到保护益生菌和维持肠道菌群平衡的作用。

此外，随着医疗水平的进步，氨基糖在治疗肿瘤方面也取得了显著疗效。随着人们生活水平的提高，肿瘤在人们的日常生活中越来越普遍，时刻威胁人类的生命安全。而氨基糖类药物能够调节宿主细胞的免疫能力，进而使胸腺细胞的免疫能力能够正常发挥作用，减少毒细胞对宿主细胞的侵害。其次，此类药物还能一定程度上加快T淋巴细胞的生长，促进牛白介素的生成，牛白介素直接激活杀伤细胞，进而杀伤细胞直接杀死肿瘤细胞[26]。牛白介素还能加快杀伤性T细胞的成熟度，进一步促进肿瘤细胞的杀死及清除。

抗阿尔茨海默病是老年人身边的常见疾病之一。加强抗阿尔茨海默病的治疗水平成为医学上正在攻克的难题。研究表明，氨基糖类药物对抗阿尔茨海默病的防治和治疗有积极作用。抗阿尔茨海默病的发病原理就是糖胺聚糖与序列中肝素的结合位点结合，从而抑制a酶的分泌，促进b酶（促进AI3的产生）的分泌。此外，糖胺聚糖还能加强蛋白酶磷酸化，从而抑制相关蛋白和微管的结合，诱发阿尔茨海默病的产生。而氨基糖类药物能够抑制氨基聚糖的形成，且能使患者自身线粒体得到修复[27]，对抗阿尔茨海默病具有一定的治疗作用。

氨基糖类药物还可用于水凝胶的制作。具有生物相容性的氨基葡萄糖单糖衍生物和其他化合物共聚可以得到全新的微凝胶，新型微凝胶由于具有良好的生物相容性、组织靶向性和对温度、pH的刺激响应性，被广泛用作缓释药物的载体[28]。研究表明，将氨基糖应用于水凝胶的制作，对于水凝胶的性能的提升具有重要意义[26]。

2.3　在农作物方面的应用

现今，香蕉枯萎病已严重影响香蕉种植业的发展，这是由一种尖孢镰刀菌古巴专化型菌引起的植物疾病。该菌产生的厚垣孢子在土壤、腐殖质以及非寄主植物中可生存长达几十年。研究学者通过氨基糖的添加实验证明，添加氨基糖N-乙酰葡糖胺可抑制厚垣孢子的形成[29]。该研究为尖孢镰刀菌古巴专化型厚垣孢子的形成和侵染机理提供了理论基础。

2.4　在其他方面的应用

除此之外，氨基糖在实验仪器上也有所应用。ZSM-5是一种具有独特微孔结构的沸石分子筛。刘宇[30]认为氨基糖的加入有助于分子筛的生长，因此在氨基糖等的辅助下，利用晶种法成功的合成ZSM-5沸石分子筛。在自然界中储量丰富的生物相容性良好、可生物降解的自然资源甲壳素为原料制备的氨基糖类表面活性剂是一类新型绿色高效表面活性剂，其具有良好的表面活性、乳化性等性质，预期在石油、食品、纺织印染、环保等领域应用[31]。

3　氨基糖研究存在的问题及应用前景

氨基糖可以用在医药、农作物和生物标志物等领域，对研究环境中碳、氮循环路径、氨基糖材料等都具有非常重要的意义。因此，对氨基糖分析的方法的研究受到越来越多领域的科研工作者的重视。本文总结了氨基糖的各种分析方法，并对其应用领域进行了详细介绍。近年来科研人员对氨基糖及其衍生物的研究正不断完善，使人们对氨基糖的应用有更完善的认知。因此，对土壤中氨基糖含量的变化特征、氨基糖药物载体等各方面的研究具有重要意义。

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Research Progress on Analytical Method and Application of Amino Sugar

Amino sugars are a kind of compounds that exist in soil microorganisms and their residues. They are often used as biomarkers of microbial residues. This paper studies the circulation of organic matter in soil and the role of microorganisms in soil, and describes the research progress in the detection technology and application of amino sugar.

amino sugar; detection technology; application; research progress

O622

A

1008-1151(2022)03-0041-04

2021-12-28

蓝丽（1970－），女，中国科技开发院广西分院工程师，从事科技项目评估、验收工作。