循环肿瘤细胞在结直肠癌临床诊疗中的应用

武彤彤，何清莲，蔡 方，许萍榕，朱 伟*（.广东医科大学病理学系，病理学技术教研室，广东东莞 53808；.惠州市中心人民医院病理科，广东惠州 5600）

循环肿瘤细胞（CTCs）是从实体肿瘤以及转移瘤中自发脱落的肿瘤细胞，进入血液循环且携带有与原发肿瘤细胞一致的分子遗传学改变[1]。肿瘤细胞进入血液系统后，在血液冲击力及血液中各种免疫因子的协同下发生部分凋亡。有些肿瘤细胞在一定的条件下，通过各种微环境的改变逃脱免疫监管，发生上皮间质转化（EMT），聚集形成CTC 簇或循环肿瘤微栓，以及循环肿瘤干细胞（CSCs）等相关CTCs 亚群。这些CTCs在体内微环境的调控下可发生间质上皮转化（MET），又转变成具有上皮细胞表型的肿瘤细胞，重新获得上皮细胞特征并在远处器官形成转移灶。这是一个复杂的病理过程，可能有多要素、多步骤、多路径以及多种基因共同参与。本文对CTCs 在结直肠癌临床诊疗中的应用作一综述。

1 CTCs 的相关性研究

1.1 CTCs 与EMT、MET

EMT 过程是指上皮细胞由于发生基因的改变转化为间质细胞的过程，可致细胞极性、侵袭性、运动性、粘附性等特性发生改变，失去与基底膜的连接，使上皮细胞获得迁移能力。在这一过程中形成的CTCs 是结直肠癌（CRC）浸润转移的重要载体。CTCs 上皮细胞表型下调，E‐钙黏蛋白下调，使细胞粘附性降低，肿瘤细胞分离；N‐钙黏蛋白上调，增加细胞侵袭性及转移性；游离β‐连环蛋白增多，导致细胞持续增殖、侵袭和转移，参与多种肿瘤的形成[2]。进入血液循环的肿瘤细胞发生EMT，形成CTCs，故上皮来源的恶性肿瘤细胞取得迁移和转移能力是EMT 直接参与的过程。

CTCs 侵出血管，在体内微环境的调控下可发生MET，又转变成具有上皮细胞表型的肿瘤细胞，重新获得上皮细胞特征并形成新的转移灶。这种表型间的相互转化，称为表皮可塑性，该特征引起CTCs 增生、转移及侵袭能力增强，促使其逃避免疫监管，进而发生远处转移[3]。

1.2 CTCs 与CSCs

CSCs 是指循环肿瘤细胞中具备干细胞特性的一部分细胞。干细胞特征包括自我更新、无限增殖及多分化潜能性和耐药属性。CSCs 可参与诱导引起EMT[4]，这是导致恶性肿瘤复发和转移的根本原因[5‐7]。自我更新是维持干细胞特性的必要条件，能够抵抗放化疗，且CSCs 具有顽强的侵袭和转移力，导致治疗失败；干细胞具有无限增殖和多分化潜能性的生物学特性，通过突变成为肿瘤干细胞。所以肿瘤干细胞具有寿命长、增殖性低的特点，对细胞毒性条件具有抵抗能力。CSCs 具有干细胞的耐药属性，因此在CRC 中对放化疗不敏感，致使肿瘤的持续存在和复发，成为CRC治疗的主要难点[8]。

1.3 CTCs 与ctDNA

循环肿瘤DNA（ctDNA）属于细胞游离DNA 的一部分，是由肿瘤细胞在发生不可逆性损伤时释放的、携带肿瘤特异性遗传物质的自由基因组片段[9]。它包含了肿瘤的遗传学信息，即肿瘤组织的异质性和基因突变[10]。研究表明，DNA 甲基化在肿瘤发生发展过程中是一种关键的表观遗传学修饰机制，通过检查ctDNA 的甲基化状态对于CRC 的诊断、指导靶向治疗、预估治疗效果和预后等均有重要作用。Garrigou等[11]研究发现，DNA 甲基化改变与CRC 发生发展密切相关，通过检测DNA 甲基化状态，实现CRC 的早发现早诊断。姜惠琴等[12]通过检测165 例晚期CRC 患者血浆的ctDNA，发现ctDNA 中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA 基因突变检出率分别为27.30%、2.42%、6.06% 和9.70%。在另一项研究中，通过分析23 对CTCs 和ctDNA 样本中K‐Ras、BRAF 和P13KCA 基因的高突变位点，发现在CTCs 和ctDNA 中突变具有高度一致性：K‐Ras 基因突变有78.6% 一致性，BRAF突变有73.9%一致性，P13KCA 突变有91.3%的一致性[13]。这一结果表明CTCs 和ctDNA 的同源性[14]，二者临床意义相似，尤其是ctDNA 检测能够预测转移性CRC 的疗效和预后[15‐17]。

有文献对1 076 例CRC 患者进行分析后发现，ctDNA 值大于治疗前中位值的患者预后较差[18]。目前，CTCs 在临床多应用于判断预后、复发风险评估和疗效监测，而ctDNA 主要应用于靶向药物使用的评估和耐药性检测；而两者均与疾病发展、肿瘤负荷、治疗反应等有关，因此二者联合检测应用对临床工作的指导具有更大意义[19]。

2 CTCs 与CRC 临床病理特征的关系

郭华等[20]采用CyttelTM‐CTC 平台检测技术（即阴性富集技术结合免疫荧光原位杂交法）检测CRC 患者、结直肠良性病变患者及健康者的外周血，结果显示CRC 患者中CTCs 阳性率为78.9%，而良性病变和健康者中CTCs 阳性率仅为6.9%，前者检出率与后者相比差异有统计学意义。Tsai 等[21]首先利用肠镜筛查出腺瘤到CRC 的患者，然后检测其CTCs，观察到25%的患者被评估为癌前病变，75%的患者被评估为CRC，CTCs 检出癌前病变的灵敏度为76.6%，特异度为97.3%；检出CRC 的灵敏度为86.9%，特异度为97.3%。以上的研究说明在CRC 患者中CTCs 检出率远高于良性病变和健康者中的CTCs 检出率。晏玉武[22]检测71例CRC 患者外周血中CTCs，发现CRC 浸润范围、分级程度、TNM 分期、淋巴结转移等预后不良的指标越高，CTCs 的阳性率越高。研究观察到早期CRC 患者的肿瘤体积、部位、分化情况、转移范围等都有可能使CTCs 的水平发生变化；此外TNM 分期越高，CTCs 的数目越多。另有研究发现，术后CTCs 的数值与肿瘤的侵袭范围及发生部位有关，但手术前后的CTCs 水平在年龄、性别和肿瘤病灶的分化情况之间均未发现存在相关性[23‐24]。随着TNM 分期增加，CTCs 检出率显著升高。

CTCs 计数被认为是影响预后独立因素之一，CTCs 数量随着淋巴结转移、远处转移的发展而增加。CTCs 的水平与无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）密切相关，可作为评估疾病预后、预测复发风险的重要指标[25]。核酸水平上一项Meta 分析发现，在非转移性CRC 中，通过PCR 方法检测CTCs 阳性患者的OS 和PFS 较CTCs 阴性患者明显缩短，且CTCs 与许多预后不良指标相关，如淋巴结转移、血管侵犯、肿瘤分化程度低及TNM 晚期等[26]。在早期前列腺癌、乳腺癌和CRC 中应用CellSearch 系统，每7.5 mL 外周血中有≥5个CTCs 是PFS 减少的有效预测指标[27]。但在大型研究中CRC 通常使用≥3 CTC/7.5 mL 的血液阈值作为临界值[28]。因此，CTCs 的检出率和计数与CRC 病理分期显著相关，与苟苗苗等[29]的研究结果一致，即CRC 晚期转移性患者CTCs 阳性率高于III 期患者；KRAS 突变患者CTCs 阳性率高于未突变患者；CRC 肝转移患者CTCs 阳性率高于无肝转移患者；转移器官数目≥2 个的CTCs 阳性率高于器官转移数目<2 个的患者。另外，CEA 是CRC 诊断和监测治疗反应的标记物，CTCs 水平与肿瘤标志物CEA 和CA19‐9 阳性呈显著正相关[29]，与蒋晓芬等[30]的研究结果一致。所以在CRC 诊断中二者进行联合检测，可提高诊断准确率。

2020 年美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer,AJCC）首次把CTCs 纳入肿瘤TNM 分期系统[31]。CTCs 是疾病与预后评估的独立预测指标，且CTCs 计数越多，危险度越高，预后越差。目前，CTCs在肺癌、头颈部恶性肿瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤的预后评估中广泛应用[32‐36]。

3 结语

CTCs 是探索CRC 发生转移机制的理想载体，运用其检测技术到胃肠道恶性肿瘤及其他实体肿瘤各个方面，用于疾病预后判断、复发风险评估、指导靶向用药及耐药性监测等[37]。但CTCs 的相关性研究与CSCs之间的关系、CRC 转移的调控因子对CTCs 的作用、研究CTCs 与CSCs 的基因表型及相关性，能否为CRC的诊断与治疗提供有用的分子标记物和靶点等方面的研究仍有待深入开展，从而进一步揭示CRC 发生和发展的秘密。