2021年国内外蜂毒研究概况

2022-03-24王康莉李珊珊胡福良

蜜蜂杂志 2022年10期

王康莉,李珊珊,胡福良

（浙江大学动物科学学院,浙江杭州 310058）

蜂毒是工蜂毒腺和副腺分泌的一种具有芳香气味的无色透明液体。作为重要的蜂产品，蜂毒的应用历史悠久。近年来，随着研究的不断深入，蜂毒的应用领域越来越广泛。关注国内外蜂毒研究动态，了解蜂毒研究热点，有助于我国蜂毒科学研究走向深入，有助于蜂毒产业的健康可持续发展。本文对2021年国内外蜂毒的研究概况进行了综述，对公开发表的中英文研究性论文的地域分布和研究领域进行了统计分析和评述，并重点介绍了蜂毒在化学成分、生物学活性领域的研究新进展。

1 蜂毒相关论文统计

1.1 论文数量及地域分布

根据 Google Scholar、Elsevier、Springerlink、NCBI、Web of Science、中国知网等数据库的搜索结果，2021年度国内外发表与蜂毒相关的中、英文研究论文共81篇，包括58篇SCI收录论文，4篇普通英文论文，以及19篇中文论文，其中9篇是中文核心期刊论文。

在58篇SCI论文中，第一作者单位是中国的有13篇，仅次于韩国的14篇，位居论文数量第二位。接着是埃及（8篇）、伊朗（4篇）、美国和波兰（3篇）、德国（2篇），加拿大、巴西、土耳其、黎巴嫩、泰国、英国、沙特阿拉伯、克罗地亚、摩洛哥、也门和印度各发表了1篇。

1.2 研究领域分布

2021年蜂毒研究仍然主要集中于化学成分、质量检测和生物学活性。在58篇SCI论文中，有50篇是有关蜂毒及其活性成分的生物学活性研究，有8篇是有关蜂毒成分、理化特性和质量检测的研究。

2 蜂毒研究新进展

2.1 蜂毒质量控制研究

蜂毒的质量受到蜜蜂种类和取毒方式及环境等因素的影响。作为CLOSS《BEEBOOK》蜂学研究方法系列丛书的组成部分，De Graaf等[1]发表了西方蜜蜂蜂毒研究的标准方法，规范了蜂毒收集、表征和储存方法，蜂毒生物学活性的测定方法，以及新的蜂毒过敏原定名的流程。Luo等[2]在其综述中指出，收集蜂毒时往往采用电击和挤压诱导蜜蜂蜇刺，在蜂箱入口处安装收集器，收集蜂毒，再使用10 kda再生纤维素膜对蜂毒进行超滤。在蜂毒采集过程中，如何标准化地采集蜜蜂毒液一直没有得到解决。Flanjak等[3]通过将传统的在蜂巢入口处放置收集器收集蜂毒的方法，改换为在蜂箱内放置收集器收集蜂毒，结果显示，蜂箱内放置收集器不仅可以收集更多的蜂毒，而且能有效地避免蜂毒污染，提高采集蜂毒的质量。产地和环境对采集的蜂毒质量也有明显的影响。El Mehdi等[4]在摩洛哥东北部、中部和南部三个地区采集的15份蜂毒液样本中，发现其主要成分，如蜂毒肽、蜂毒明肽和磷脂酶A2等的含量变化受到采集区域的影响。此外，经过检测发现，蜂毒样本中的镉、铬和铅等有毒元素的含量均低于5×10-6mg/kg，处于质量安全范围内。

2.2 蜂毒化学成分研究

蜂毒的pH值为4.5～5.5，其成分主要包括：蜂毒素、蜂毒明肽、安度拉平、肥大细胞脱颗粒肽、磷脂酶A2、透明质酸酶和非肽成分（组胺、多巴胺和去甲肾上腺素）。采集的新鲜蜂毒，与空气接触后，容易失去一些挥发性成分，所以，以往研究蜂毒成分和活性主要采用干蜂毒，其中，蜂毒肽约占蜂毒干重的50%，磷脂酶A2占12%[5]。

蜂毒中的致敏性蛋白质来源是蜜蜂蜇伤轻则局部肿胀、重则危及生命的主要因素，Burzynska和Piasecka-Kwiatkowska[6]综述了蜂毒中的过敏原及其致敏性研究进展，其中有12种蛋白质被世界卫生组织（WHO）的“过敏原命名委员会（IUIS）”认定为“过敏原”，主要是分子量在3～200 kDa之间的酶和糖蛋白，与IgE交叉反应，引发机体免疫。引起过敏的蛋白酶包括：具有细胞毒性的磷脂酶A2(Api m1)、透明质酸酶、酸性磷酸酶（Api m3）和具有溶血特性的蜂毒素（Api m4），还有能引起疼痛和降低血压的组胺、具有局部细胞毒性潜能的多巴胺和儿茶酚胺，它们会加重过敏的程度。

2.3 蜂毒生物学活性及其作用机制研究

蜂毒因其特有的成分，在抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖血脂、保护肝脏神经系统等方面有强大的生物学活性，主要涉及医药、保健和化妆品等行业。Khalil等[5]从体外和临床预试验方面综述了蜂毒的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌活性。El Mehdi等[4]采集摩洛哥三个地区的15份蜂毒液样本进行抗炎、抗肿瘤活性评价，发现这些蜂毒在小鼠巨噬细胞上显示出了显著的抗炎效果，对人肿瘤细胞系（包括乳腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、肝细胞癌和恶性黑素瘤）均有抗增殖作用。Guha等[7]则综述了蜂毒肽基于与脂质双层膜结合，折叠成两亲α-螺旋二级结构，破坏膜的通透性屏障的特点，从而起到抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫等功效。基于蜂毒对皮肤炎症的治疗作用，Abd El-Wahed等[8]通过讨论蜂毒对过敏性皮炎、痤疮、雄激素源性脱发、伤口愈合、面部抗皱、白癜风、牛皮癣的治疗作用，提出蜂毒在化妆品领域潜在的应用前景。

2.3.1 抗菌活性

Maitip等[9]提取了西方蜜蜂、东方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂这四种蜜蜂的蜂毒，将这四种蜂毒提取物作用于革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、黄体微球菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌MRSA和表皮葡萄球菌）、革兰氏阴性菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和鼠伤寒沙门氏菌）和真菌（白色念珠菌），结果发现蜂毒提取物对革兰氏阳性菌的抑菌活性均好于革兰氏阴性菌和真菌，且4种蜂毒提取物中，东方蜜蜂蜂毒提取物的抑菌活性最好。Haktanir等[10]通过研究进一步阐述了蜂毒抗菌的作用机制。不同浓度蜂毒（75、225和500 μg/mL）作用于大肠杆菌、环境病原菌和腐败菌、恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌，发现细菌细胞壁出现明显的变形，且随蜂毒浓度的增加，细菌膜通透性和ATP损失增加，说明蜂毒是通过破坏细菌细胞壁，改变膜通透性，导致细胞内容物渗漏，代谢活动失活，从而产生抗菌作用。研究发现，蜂毒肽对耐药菌引起的三度烧伤感染有显著作用，蜂毒肽对三度烧伤感染小鼠模型的万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）具有膜溶作用，且在单次剂量为16 μg时，可有效杀死VRSA细菌，因而蜂毒在烧伤感染方面显示出广阔前景[11]。

2.3.2 抗炎活性

蜂毒作为一种天然抗炎成分，在治疗类风湿关节炎（RA）方面效果显著。在胶原诱导的RA小鼠模型中，蜂毒显著降低RA小鼠血清促炎因子内皮素-1水平，缓解RA的影响[12]。Choi等[13]进一步验证了蜂毒的主要成分——蜂毒磷脂酶A2（BvPLA2）在治疗类风湿性关节炎中的作用，结果发现PLA2显著缓解了胶原诱导的RA小鼠的关节肿胀，诱导Foxp3+调节性T细胞（Treg）极化，从而发挥治疗关节炎的作用。BvPLA2的抗炎作用主要是由Treg的增加引起的，Jo等[14]对健康人的外周血样进行BvPLA2处理，结果显示，BvPLA2显著增加了健康人外周血中Treg的比例。

蜂毒加针刺是传统的中医药疗法，将蜂毒辅以针刺的方法注入骨关节内，通过抑制促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL6、COX2和iNOS）和趋化因子（MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、GRO-α和MIP-2α）的表达，减轻炎症的产生和中性粒细胞的浸润，有效缓解了尿酸盐结晶诱导的大鼠痛风性关节炎[15]。Du等[16]为了让蜂毒在治疗RA中获得更高的给药效率，制备了负载蜂毒肽的透明质酸微针，这种含有蜂毒肽的微针在RA小鼠模型中显著抑制促炎细胞因子IL-17和TNF-α的水平，增加调节性CD4 T细胞的比例。

脓毒症相关急性肾损伤（AKI）往往伴随着炎症的产生。Kim等[17]的研究发现，蜂毒在治疗LPS诱导的AKI小鼠模型中，抑制了TNF-α和IL-6的分泌，以及蛋白和mRNA水平的表达，抑制NF-κB通路，减少免疫细胞向肾脏受损组织的浸润。蜂毒对γ射线诱导的肺损伤有显著的保护作用，蜂毒减少了肺损伤引起的炎症因子IL-1β分泌，并调节TLR4/NF-κB通路，缓解炎症，改善肺部损伤[18]。为了减少蜂毒的不良反应，更好地发挥抗炎活性，Lee等[19]将蜂毒进行脱毒处理后作用于LPS诱导产生炎症的RAW 264.7细胞，发现脱毒蜂毒能够显著降低LPS引起的炎症细胞因子（TNF-α、IL-6和iNOS）mRNA过量表达，并能有效抑制炎性通路TLR 4信号通路中IκBα蛋白的磷酸化，显示出比普通蜂毒更强的抗炎活性。L-精氨酸包被的氧化铁负载蜂毒肽形成的纳米颗粒可通过阻断巨噬细胞TNF-α激活和NF-κB信号通路，减少颅内炎症的产生，抑制MMP-9激活和细胞外基质（ECM）变性，预防颅内动脉扩张的形成[20]。

蜂毒强大的抗炎活性，使其在神经炎症的防治方面也卓有成效。Ahmed Farid等[21]在蜂毒治疗利血平诱导的帕金森病大鼠模型的研究中发现，蜂毒治疗恢复了单胺，平衡了谷氨酸/γ-氨基丁酸水平，阻止了DNA碎片，降低了促炎介质（IL-1β和TNF-α），并提高了抗炎介质（PON1）和神经营养因子（BDNF）水平，有效地辅助帕金森病的治疗。用针刺方法注射蜂毒可以改善癫痫这一慢性神经炎症引起的促炎因子水平升高，并通过动作电位的快速复极化限制神经元的兴奋性[22]。Nguyen和Lee[23]研究表明，蜂毒肽在神经退行性疾病治疗方面有潜在疗效。蜂毒肽可以有效保护海马细胞的活力，并显著解除Aβ25-35诱导的细胞内活性氧的过量生产，蜂毒肽通过调节凋亡相关因子的表达，抑制海马细胞凋亡，调节Nrf2的核易位，上调血红素加氧酶-1（HO-1）的生成，增强抗氧化防御途径。同时，结合小鼠脑组织和血清分析得出，蜂毒肽增强氧化-抗氧化平衡、胆碱能系统活性和细胞间神经营养因子调节，保护神经提高抗氧化能力、免受氧化应激。

在治疗脑内神经炎症时，血脑屏障严格控制分子和细胞进入大脑，限制治疗药物的输送。蜂毒肽因其膜活性作用短暂地支持血脑屏障开放，使药物穿过血脑屏障，达到病灶，治疗炎症，保护神经系统[24]。甲基氯化汞（MMC）是一种会引起血脑屏障损伤和神经行为改变的药物，蜂毒通过抑制MMC诱导的炎症、氧化应激和下调紧密连接蛋白基因（TJPs）mRNA表达水平，重塑血脑屏障完整性。另外，蜂毒的介入显著提高了CD31、神经丝、pan神经元指数比例，保护神经免受毒性损伤[25]。蜂毒明肽在多发性硬化症这种中枢神经脱髓鞘疾病的小鼠模型上表现出潜在的治疗作用，蜂毒明肽因其具有的血脑屏障穿透活性，促进氧化诱导的多发性硬化小鼠少突胶质细胞前体增殖，以及髓鞘含量升高，从而防止疾病恶化，保护中枢神经[26]。

2.3.3 抗肿瘤活性

相比于正常细胞，蜂毒对诱导癌细胞凋亡具有选择性，引发DNA上胞嘧啶修饰，并且导致线粒体膜通透性和线粒体DNA拷贝数的变化，以及细胞形态的改变[27]。Viana等[28]采用电刺激法采集巴西北部西方蜜蜂的蜂毒，并对其抗肿瘤活性进行检测，发现蜂毒在30、10和5 μg/mL浓度下均能显著损伤肿瘤细胞DNA，50 μg/mL和25 μg/mL浓度下显著降低人前列腺癌（PC3）、肝癌（HEPGE2）、黑色素瘤（madmb435）和星形细胞瘤（SNB19）的细胞活性。Lebel等[29]的研究也证实，蜂毒和蜂毒肽均能抑制多形性胶质母细胞瘤。Yaacoub等[30]将从蜂毒中分离出的蜂毒肽和PLA2作用于结肠癌细胞HCT116细胞，发现蜂毒肽的细胞毒作用更强，蜂毒肽和PLA2之间存在协同潜在活性，诱导HCT116癌细胞的膜破裂。蜂毒肽通过上调TNF-α和Bax的表达，诱导乳腺癌细胞凋亡，并通过下调NF-κB基因抑制HIF-1α蛋白表达，VEGFA和LDHA表达下降，有效地调节肿瘤微环境，从而抑制癌细胞扩散[31]。蜂毒肽可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤细胞肺转移。中、高浓度的蜂毒肽通过降低LRP5、β-catenin、MMP-2、cyclin D、c-Myc、survivin、MMP-9和VEGF基因和蛋白表达，以及抑制裸鼠胫骨移植瘤的生长，降低肺转移结节的数量，抑制肉骨瘤细胞的肺转移[32]。

蜂毒肽尽管对多种癌症具有疗效，但表现出非特异性毒性、严重的溶血活性和较差的药理特性，使其在临床作用中存在局限性。近年来，以蜂毒肽为基础的新型抗肿瘤药物研究越来越多。Zhou等[33]构建的以蜂毒肽为主的靶向肿瘤质粒（pcTERT-melittin）在抑制食管癌方面取得初步成效。pcTERT-melittin通过破坏肿瘤细胞线粒体膜结构和活性氧的产生，上调cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和Bax基因表达，诱导细胞通过线粒体途径凋亡和细胞G0/G1周期阻滞，降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，从而诱导食管癌细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞转移。透明质酸修饰后的蜂毒肽脂质体具有更小的溶血作用，以及更强的缓释作用，提高其抗肿瘤作用效果[34]。Jia等[35]设计的瓶刷结构聚乙二醇（PEG）和蜂毒肽的生物杂交复合物大大增强了血浆药代动力学，几乎完全消除蜂毒肽的溶血活性，大大增强了抑癌活性。设计新型的蜂毒肽纳米颗粒也是提高蜂毒肽抗肿瘤活性策略之一。将蜂毒肽中的氨基酸进行调整，装载形成新型纳米颗粒，体内诱导免疫原性细胞死亡，可提高肿瘤免疫治疗方面的效果[36]。Moghaddam等[37]设计的负载蜂毒肽的纳米颗粒经研究发现，蜂毒肽引起的溶血作用消失，且相较于蜂毒肽，靶向性强、释放率高的蜂毒肽纳米颗粒诱导的凋亡反应更强，抑制癌细胞侵袭转移能力更强，具有更好的体内抗肿瘤作用。基于蜂毒肽的抗肿瘤特性设计的新型抗肿瘤肽UM-6，通过触发Hippo-YAP信号通路，诱导宫颈癌细胞凋亡和自噬，并且体内抗肿瘤效果显著[38]。

癌症患者往往对化疗药物产生耐药性，降低了药物的疗效。蜂毒肽可作为一种潜在的化疗增敏剂，增加化疗药物的药效。Kreinest等[39]检测发现，蜂毒肽对KM-H2和L-428这两株霍奇金淋巴瘤细胞具有较高的毒性，并且通过维持ABC转运蛋白的活性增加化疗药物顺铂对L-428细胞的敏感性，减少患者因化疗药物引起的耐药性。Zhang等[40]也发现蜂毒肽增加了顺铂在非小细胞肺癌化疗过程中的敏感性。蜂毒和蜂毒肽通过晚期肝癌治疗药物索拉非尼联用调节癌相关基因的表达，从而在抗肿瘤方面产生协同作用[41]。

2.3.4 降血脂、降血糖活性

蜂毒在降血糖、降血脂方面也有一定的功效。蜂毒处理患有糖尿病高血脂的小鼠后，发现小鼠血液中的葡萄糖、总胆固醇、三酰基甘油、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇、肌钙蛋白I、肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性显著降低，心脏组织中的丙二醛、NF-κB水平以及血管细胞黏附分子-1和半乳糖凝集素-3的相对mRNA表达显著降低，心脏组织的总抗氧化能力增加，表明蜂毒通过减轻氧化应激和调节NF-κB信号通路，降低血脂血糖，改善心功能障碍[42]。Jeong等[43]对蜂毒的重要成分BvPLA2控制肥胖作了进一步的研究，发现BvPLA2处理高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠后，小鼠体重显著下降，减少肝脏组织中的脂质积累和肾脏中的炎症，降低体内促炎的M1型脂肪组织巨噬细胞（ATM），缓解体内M1/M2失衡，通过调节M1和M2型ATM的稳态来控制肥胖。

2.3.5 保护肝肾活性

顺铂作为一种普遍使用的高效抗肿瘤药物，患者在服用时往往引起肝脏毒性，蜂毒可显著缓解顺铂诱导的大鼠肝脏毒性引起的血清天门冬氨酸转氨酶、谷丙转氨酶和胆红素水平升高，此外，肝脏组织丙二醛、肿瘤坏死因子-α、干扰素γ、转化生长因子β、纤维连接蛋白和caspase-3水平显著降低，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性及谷胱甘肽水平均显著降低，肝脏组织结构恢复正常，保护肝脏免受损伤[44]。研究表明，BvPLA2对小鼠胆汁淤积性肝损伤和纤维化有积极的影响。Kim等[45]用对3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢对苯二甲酸（DDC）诱导形成胆汁淤积性肝损伤和纤维化小鼠模型，BvPLA2通过减少末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP标记细胞的数量和抑制caspase-3的激活，抑制肝细胞凋亡，抑制NF-κB通路，缓解肝脏炎症，增加Treg数量，提高肝脏免疫，从而表现出BvPLA2的保肝护肝作用。另外，Naji等[46]也对蜂毒肽对抗结核药物（异烟肼和利福平）致雄性白化大鼠肝毒性的改善情况作了探索，结果表明，蜂毒肽显著降低大鼠的还原谷胱甘肽、直接胆红素、总胆红素、谷草转氨酶、丙谷转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶和血清总蛋白水平，对抗结核药物致肝毒性的急性肝衰竭有良好的预防作用。蜂毒另一多肽成分蜂毒明肽，也有研究指出其作为潜在的治疗肾纤维化药物的可能性。蜂毒明肽通过抑制α-SMA、波形蛋白和纤维连接蛋白，减轻肾纤维化、肾小管细胞的损伤和肾小管萎缩，并且，通过抑制TGF-β1/Smad2/3和STAT3信号通路，减弱成纤维细胞的激活、细胞外基质的合成以及炎症因子的分泌，延缓肾纤维化进程，从而有效地保护肾脏[47]。

2.3.6 其他活性

Kang等[48]通过向小鼠烫伤处注射蜂毒，发现蜂毒刺激对烧伤后外周和中枢神经系统中央P物质（Sub P）的表达增加有抑制作用，步态分析显示，小鼠疼痛反应明显减轻，表明蜂毒在治疗烧伤性疼痛方面具有积极的作用。还有研究表明，蜂毒通过单独或者与聚乙烯醇、壳聚糖等联合使用，促进创面愈合和修复[49]。蜂毒还具有生殖保健功能。蜂毒对家兔的繁殖、免疫健康状况具有显著的提升作用[50]。家兔注射蜂毒后，血清中的雌二醇17-β(E2)升高15%，黄体酮则下降12%，受孕率和生育率显著提高，增强了家兔的繁殖性能；此外，蜂毒还提高了家兔血清总抗氧化能力和抗氧化酶（如谷胱甘肽s-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶、IgG），且降低了丙二醛和硫巴比妥酸反应物质（TBARS）、IgM和IgA水平，改善了家兔的免疫状况，保障机体健康。