不同生长年份桑黄中活性成分动态分析

宋吉玲，郭莎莎，孙朝国，舒玉婷，方晨依，李福森，王晶*

（1.长春师范大学化学学院，吉林 长春 130032；2.中科微针（北京）科技有限公司，北京 102629）

桑黄（Phellinus igniarius）别名桑耳、桑上寄生等，是一种珍贵的大型多年生食药用真菌，主要生长于桑树、杨树、山楂树等树干或树桩上，在我国的云南、四川、辽宁、吉林、黑龙江等地分布较为广泛[1-2]。传统中医中桑黄一般以子实体入药，其味微苦，性寒，具有活血、化饮、利五脏、排毒等功能，常用于治疗血崩、经闭、脱肛止血、脾虚泄泻等症[3]。桑黄中含有多种活性成分，其中黄酮、多糖、三萜和酚类物质为主要有效成分[4-6]，而吡喃酮类化合物是桑黄中发现的新骨架化合物。研究表明，桑黄具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、抑菌、消炎、保肝护肝等多种活性作用[7-8]。

由于受生理状态的特殊性、复杂性以及外部环境的制约，自然界中野生桑黄稀少，且大量开采野生桑黄，易导致野生资源急剧下降。近年来，人工栽培桑黄的产业蓬勃发展，许多地区都在发展桑黄栽培产业，但所产桑黄的品质却参差不齐。液体深层发酵技术具有无菌、生产条件可控、短时间内可获得大量细胞产物和代谢物，以及可自动化控制、规模化生产等优点。然而，深层发酵的桑黄菌丝体以及人工栽培的桑黄子实体的质量和化学成分与野生桑黄子实体存在一定差异，且不同年份人工栽培的桑黄有效活性成分也有较大差异，不同品质的桑黄大量充斥着原材料市场，难以保障所产桑黄的品质。因此，对不同条件培养的桑黄进行质量控制十分必要。通过桑黄质量控制，能够保证桑黄质量，为桑黄的深入研发提供基本保障[9-10]。药效物质是保障药品质量的前提，因此对于桑黄中有效成分的研究具有重要意义。目前，我国对于桑黄有效成分的研究主要集中在多糖类化合物及药理活性等方面。而对于桑黄菌丝体、人工种植桑黄以及野生桑黄中的活性成分对比分析的研究较少。高效液相色谱法广泛应用于天然产物的分析和分离[11-13]，可以实现分析比对不同年份桑黄活性成分的种类以及含量的差异。

本文以同一桑黄菌种的菌丝体、一年生、两年生、三年生、四年生子实体及野生桑黄子实体为研究对象，对不同桑黄提取物中主要活性成分的种类及含量进行分析及对比，并应用液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectroscopy，LC-MS） 技术进一步分析并初步鉴定桑黄提取物中的主要化学成分，为桑黄药效物质的研究及药品质量控制提供一定理论基础和支持[14]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑黄菌种（菌丝体、一年生桑黄子实体、两年生桑黄子实体、三年生桑黄子实体、四年生桑黄子实体）：长春师范大学应用生态学研究所食药用菌栽培基地；野生桑黄子实体（五年生）：吉林延边华厦有限公司。

葡萄糖：天津市光复科技发展有限公司；焦性没食子酸标准品（≥98%）、福林酚：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、浓硫酸、苯酚、冰醋酸、碳酸钠、无水乙醇（均为分析纯）：北京精细化学品有限公司；甲醇、醋酸（均为色谱纯）：加拿大Caledon Laboratories公司。

1.2 仪器与设备

LCQ-FLEET液相色谱-质谱联用仪（配备二极管阵列检测器）：美国赛默飞世尔科技有限公司；YoungLin Istrument超纯水仪：韩国Younglin Istrument公司；FW-100型高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；KH-250 DB型数控超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司；Hei-VAP型旋转蒸发仪：德国Heidolph公司；Flex Station 3型多功能读板器：美国Molecular Devices公司；FA1204A电子分析天平：德国赛多利斯公司；HWY-2102C水平摇床：郑州宏郎仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

桑黄菌丝体制备（PDA培养基）：200 g土豆去皮后置于烧杯中，加1 000 mL超纯水加热并过滤，液体中加入20 g葡萄糖、5 g蛋白胨制备培养基，灭菌。将桑黄菌种活化后接种到灭菌的培养基中，在温度27℃、转速150 r/min条件下，恒温摇床培养15 d，制得桑黄菌丝球。过滤并用超纯水洗涤3次，放入45℃烘箱中烘干，称取干重。将人工栽培及野生桑黄子实体进行粉碎，过60目筛，密封保存。

1.3.2 桑黄中有效成分的提取方法

桑黄中总多糖的提取：分别称取6种桑黄样品1 g（准确至 0.001 g），按料液比 1 ∶30（g/mL）加入超纯水，温度45℃，超声辅助提取1 h，抽滤，滤液加入无水乙醇醇沉，封闭隔夜，过滤，滤液减压回收至无醇味，浓缩液用水定容至2 mL，浓度为500 mg/mL，放入4℃冰箱保存，待用。

桑黄中总多酚的提取：提取总多糖后剩余的6种桑黄样品粉末残渣，继续加入30 mL甲醇，温度55℃，超声辅助提取1 h，抽滤，滤液减压回收至干，用甲醇定容至2 mL，得到桑黄醇提物，放入4℃冰箱中保存，待用。桑黄样品在进行LC-MS检测前，用0.45 μm滤膜过滤。

1.3.3 桑黄中成分含量的测定方法

总多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法测定桑黄中总多糖。分别取 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 的0.10 mg/mL葡萄糖标准溶液于6支离心管中，加入超纯水至0.10 mL，继续加入0.10 mL 5%苯酚、0.50 mL浓H2SO4，振荡摇匀，静置 10 min，取 200 μL 溶液于 96 孔板中，30℃下放置20 min，于490 nm测吸光度A，平行测定3次。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，制作标准曲线。于490 nm处测定样品溶液吸光度，由葡萄糖标准曲线的回归方程求出反应体系中的葡萄糖浓度。总多糖含量/%=样品中多糖浓度/样品粗提物浓度×100。

总多酚含量测定：总多酚含量采用福林酚法。准确称量焦性没食子酸标准品1 mg置于10 mL离心管中，加蒸馏水定容至刻度线，制成浓度为0.10 mg/mL的焦性没食子酸标准品溶液，标记为母液。分别取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL的 0.10 mg/mL母液于 6支离心管中，补超纯水至0.10 mL，依次加入0.50 mL 10%的福林酚混匀后再加入1.40 mL 10%Na2CO3，振荡摇匀，取200 μL溶液于96孔板中，避光25℃下放置30 min，于760nm波长测吸光度A，平行测定3次。以焦性没食子酸浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，制作标准曲线。总多酚含量/%=样品中多酚浓度/样品粗提物浓度×100。1.3.4 LC-MS测定条件

液相色谱分析条件：流动相为色谱甲醇（A）和0.2%醋酸水溶液（B）；色谱柱为Thermo U3000 C18（250 mm×4.6 mm）；柱温25℃；检测波长280 nm；流速0.5 mL/min；进样量 10 μL。程序梯度：0 min，20%A+80%B；10 min，30%A+70%B；40 min，45%A+55%B；60 min，50%A+50%B；90 min，60%A+40%B。

利用LC-MS技术分析桑黄提取物中的有效成分，在负离子模式下进行全扫描。鞘气40 bar；辅助气10 bar；毛细管温度350℃；毛细管电压35 kV；透镜电压110 V。二极管阵列检测器（photo-diode array，PDA）检测波长280 nm；进样量为10 μL。

1.4 数据处理

结果数值以平均值±标准差表示，运用Origin 8软件和Chewdraw分别进行绘图及化学结构式绘制。

2 结果与分析

2.1 不同桑黄中总多糖、总多酚含量评价

以葡萄糖（mg/mL）浓度为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得到回归方程：y=2.707 3x-0.002 5，相关系数r=0.999 7，线性范围0～0.1 mg/mL；以焦性没食子酸（mg/mL）浓度为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得到回归方程y=5.95x-0.002 7，相关系数r=0.999 7，线性范围0～0.1 mg/mL。以上结果说明在不同浓度范围内，浓度与吸光度存在良好的线性关系，可用于桑黄中总多糖、总多酚类化合物的定量分析。

本研究应用多功能读板器进行桑黄提取物中总多糖、总多酚含量测定，该方法的主要优点包括样品用量少、高通量检测、速度快、准确度高等[15]。为保证不同桑黄提取物中在进行含量测定时的吸光度（A）能够处于合理的范围内（0.2～0.8），需要对提取物溶液浓度调整，经过多次试验，选择桑黄总多糖提取物的浓度范围为2.0 mg/mL～10.0 mg/mL，总多酚测定样品浓度范围5.0 mg/mL～25.0 mg/mL。将桑黄不同提取物按照上述浓度范围进行稀释，采用苯酚-硫酸法、福林酚法对不同桑黄提取物中的总多糖、总多酚进行含量测定，结果如表1所示。

表1 6种不同桑黄中总多糖、总多酚含量Table 1 Content of polysaccharides and polyphenols in six kinds of Phellinus igniarius

如表1所示，对比研究6种不同桑黄样品中总多糖、总多酚含量，发现不同年份桑黄中有效成分含量存在较大差异。不同桑黄总多糖含量对比中，不同年份人工栽培的桑黄子实体和液体发酵培养的桑黄菌丝体中总多糖含量高于野生桑黄子实体含量，桑黄子实体（一年生）总多糖含量最高，达到0.754 1%，其次为桑黄（两年生）总多糖含量（0.703 7%），其他样品总多糖含量有所减少。野生桑黄子实体总多糖含量最低，为0.329 8%。可能是由于野生桑黄在自然环境中的营养物质地获取有限，比人工管理环境中获得养分更艰难。此外，桑黄是多年生真菌，而该野生桑黄约五年生，与人工栽培桑黄生长年份相差不明显，因此其中总多糖含量偏低。对于液态发酵的桑黄菌丝体，不同碳源、氮源、时间、温度等因素都会对总多糖含量产生影响，但菌丝生长过程中营养物质充足，总多糖含量相对较高。

如表1所示，野生桑黄子实体总多酚含量最高，为0.255 2%，而桑黄液体发酵菌丝体总多酚含量最少，为0.030 8%，其余桑黄中总多酚含量相差不明显，为0.156 6%、0.167 4%、0.175 3%和0.180 2%。多酚类包含化合物种类较多，如黄酮类、吡喃酮类等，皆属于次生代谢产物，可能随着时间的延长，该类代谢产物会逐渐累积，而深层发酵培养技术时间短，所以总多酚类含量较低。

通过对不同桑黄子实体提取物中总多酚含量进行比较，发现一年生到四年生的桑黄子实体中总多酚含量相差不明显。一年生到三年生桑黄子实体中总多酚含量存在逐年降低趋势，四年生桑黄子实体中总多酚含量相对较高，可能原因是栽培条件对桑黄中总多酚等次级代谢产物含量影响较小。由表1分析可知，四年生桑黄子实体中总多酚含量较高，而总多糖含量较低，分析可能是在四年时桑黄处于初级代谢产物向次级代谢产物过渡时期。而野生桑黄子实体中总多酚含量最高，推测桑黄作为一种多年生真菌，当达到生长稳定期后，其子实体中次生代谢产物的含量会随着生长年份的增长而累积。

2.2 桑黄醇提物中活性成分分析与比较

由于不同桑黄提取物中总多酚类化合物的含量有明显的变化，同时为了考察人工栽培桑黄与野生桑黄中主要活性成分是否存在较大差异，采用LS-MS对不同桑黄醇提物进行分离并对结果进行分析，结果见图1。

图1 不同年份桑黄序列液相色谱图Fig.1 Sequence liquid phase diagram of different years

如图1所示，不同桑黄提取物中主要化学成分均能得到较好分离，但桑黄菌丝体色谱图较其它桑黄样品差异较大，样品中色谱峰数量较少，可能与其多酚类化合物含量较低有关。对比不同桑黄提取物的色谱图，选择分离较好的6种化合物作为目标成分进行分析。不同桑黄样品中，6种目标化合物的峰高（峰面积）存在明显差异，说明提取物中主要成分的含量变化较大。野生桑黄子实体提取物的色谱图与4种不同年份人工栽培桑黄子实体色谱图对比发现，6种目标化合物的保留时间基本一致。结果表明，不同桑黄提取物中大部分峰为共有峰，这说明人工栽培桑黄与野生桑黄提取物中含有主要化学成分的种类较为相似。由图1可知，野生桑黄提取物中目标化合物色谱峰明显，分布均匀，而人工种植桑黄子实体中有效成分与其相比，目标化合物的出峰情况有明显变化。对比不同桑黄色谱图，发现其主要活性成分的含量存在差异，例如化合物1随着种植年限的增加含量也逐渐增大，四年生桑黄子实中其含量与野生桑黄含量基本一致，推测四年为目标化合物1在桑黄中含量积累最佳时间。但它的含量是否会随着时间继续增加，有待进一步分析。在一年生桑黄中目标化合物4和5的含量高于其他年份种植桑黄，甚至高于野生桑黄，但其在二年生桑黄和三年生桑黄中含量明显减少，推测该化合物在短时间内累积较快，但达到一定量后随着时间延长，可能向其他成分发生转变。

为了进一步分析桑黄醇提物中的活性成分，利用LC-MS技术进行目标化合物的快速结构鉴定，通过与相关文献进行对比[16-19]，根据化合物的色谱数据以及分子量、碎片离子等质谱信息（见表2），初步对桑黄醇提物中6种主要化合物进行了定性分析，可能结构式如图2所示。

表2 桑黄醇提物的LC-MS数据Table 2 LC-EIS-MS data of alcohol extract from Phellinus igniarius

图2 6种化合物的结构式Fig.2 Structural formula of 6 compounds

3 结论

近年来，由于野生桑黄的大量开采，导致其数量急剧下降甚至成为稀缺产品。而一些品质不好的人工种植桑黄产品在市场中普遍存在，无法保证桑黄的药效性。本试验采用液态深层发酵技术培养桑黄菌丝体，并选取基地同一菌种（一年生桑黄子实体、二年生桑黄子实体、三年生桑黄子实体、四年生桑黄子实体）进行培养，评价其中总多糖、总多酚含量，并与野生桑黄中的活性成分含量进行对比。同时进一步利用LCMS分析了桑黄醇提物中6种目标化合物的差别。结果表明，如果做好人工桑黄的种植管理，桑黄总多糖含量并不一定会低于野生桑黄，有的甚至更优；根据桑黄中总多酚含量结果，推测随着年份的生长有利于总多酚含量的累积。LC-MS结果表明，不同生长年份桑黄提取物中大部分峰为共有峰，而人工栽培桑黄与野生桑黄提取物中的主要化学成分的种类较为相似，并且人工栽培桑黄中个别成分高于野生桑黄。因此，对于野生桑黄资源稀缺的现状，人工栽培桑黄可能会弥补该缺口。该研究为人工栽培桑黄的质量控制以及相关产品开发提供一定支持。