高甘油三酯血症动物模型研究进展

2022-03-24关媛媛郑燕飞朱玲慧王立英白帆李天星孙紫薇李玲孺

中国实验动物学报 2022年1期

关媛媛郑燕飞朱玲慧王立英白帆李天星孙紫薇*李玲孺*

(1.北京中医药大学中医学院,北京 100020;2.北京中医药大学国家中医体质与治未病研究院,北京 100020)

高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia,HTG)是血脂异常的重要表现,通常定义为空腹血清甘油三酯(triglycerides,TG)≥150 mg/dl[1]。HTG的发生是由于体内TG水平升高,即富含TG的脂蛋白(triglyceride-rich lipoproteins,TGRL)加工和分解代谢改变或血浆TG清除率降低[2]。HTG与肥胖、代谢综合征和糖尿病密切相关也是诱发急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)和增加动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)风险的重要影响因素之一[3]。

他汀类药物是治疗高脂血症的首选药但他汀降TG的作用有限。根据2007～2014年美国健康与营养调查(NHANES)数据显示HTG的总体患病率为25.9%,其中接受他汀类药物治疗患者的患病率为31.6%[4]。HTG也是我国高脂人群中常见的血脂异常类型。2012年全国调查结果显示高胆固醇血症的患病率为4.9%,HTG的患病率为13.1%,约是高胆固醇血症患病率的3倍[5]。临床上降脂的首要目标是降低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平,但即使患者经标准治疗LDL-C达标后,仍可能发生心血管事件(cardiovascular disease,CVD),尤其是使用他汀治疗后TG不达标患者CVD的发生风险远高于TG达标者[6]。有研究表明降TG与降LDL-C的临床效益是相似的且可能与载脂蛋白B(ApoB)的绝对减少有关这使HTG成为当前的研究热点[7]。成功建立符合要求的动物模型是开展相关实验研究的关键,然而目前HTG的造模方法还未成熟完善,很少有研究对其进行系统总结归纳。现本文根据时间分类(急性、慢性、先天性)对HTG动物模型做一概述以期为深入研究HTG的潜在发病机制和降TG药物的筛选提供动物模型参考。

1 急性HTG动物模型

1.1 注射法

注射类方法是通过一次性实验动物尾静脉注射、腹腔注射或皮下注射使其血清TG一过性快速升高的一种造模方法。此方法简单、便捷、可控,可使实验动物处于高水平的TG状态[8]。但这种高TG状态呈剂量依赖性且持续时间不长,与人类发病机制差异较大与临床病症特点的吻合度也仅为34%一般常用于降脂药物的初筛和药效评价[9]。目前用注射类方法建立急性HTG动物模型的造模方法有Triton-WR1339(TWR)注射法、poloxamer-407(P-407)注射法和chlorpyrifos(CPF)注射法。

TWR和P-407均是一种表面活性剂,可通过直接抑制脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)和肝脂肪酶的活性来增加血清TG浓度和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)的含量[10-11]。研究表明,Zarzecki等[10]给雌性C57BL/6小鼠腹腔注射TWR(400 mg/kg)可在24 h内引起急性HTG,血清TG可升至正常小鼠的20倍左右,升TG效果显著,常用于HTG调脂药物的筛选,但其不足之处是药品成本较高。Yeom等[12]给雄性SD大鼠一次性腹腔注射P-407(400 mg/kg)也可在24 h内迅速升高血清TG和TC。研究表明P-407的毒性非常低,长期使用也可确保小鼠的安全性[13],是目前诱导混合型急性高脂血症动物模型的常用方法。CPF是一种有机磷杀虫剂,其诱导急性HTG的机制尚不清楚。Acker等[14]研究表明,单次CPF皮下注射(50 mg/kg)给药可快速导致雄性Wistar大鼠TG和LDL-C水平增加,且使高密度脂蛋白(High density lipoprotein cholesterol,HDL)水平下降可作为一种研究CPF促动脉粥样硬化的动物模型。Ono等[15]研究表明,通过将其腺病毒注射到雄性C57BL/6小鼠体内,在肝脏中过度表达NH(2)-末端豆蔻酰化信号附加的Akt(myristoylation signal-attached Akt,myr-Akt),也可导致显著的高甘油三酯血症,并伴有脂肪肝和肝肿大,这可能是Akt诱导SREBP-1表达和独立于SREBP-1的脂肪酸合成机制共同作用的结果。

1.2 灌胃法

与高脂饮食喂养相比,灌胃法可以保证动物间食物摄入量的一致性,建模周期相对较短,避免了饮食喂养法引起的动物厌食现象。缺点是乳液应低温储存,口服困难,动物容易腹泻或消化不良,实验动物容易死亡等[16]。现阶段,建立HTG动物模型常用的灌胃方法有五味子素B溶剂(schisandrin B,Sch B)灌胃法、果糖水灌胃法和食用油灌胃法等均可在较短时间内引起动物血清TG升高。

研究表明,用橄榄油配制五味子素B溶剂(Sch B)给雄性ICR小鼠灌胃,能够在48 h快速升高小鼠TG是一个实用且简便的急性单纯性HTG动物模型[17]。Sch B诱导的高甘油三酯血症和肝脂肪变性是由脂肪分解:脂肪细胞大小减少和血清非酯化脂肪酸(nonestesterified fatty acid,NEFA)增加以及外源性来源血清载脂蛋白B48(apolipoprotein,Apo B48)增加引起的[18]。当Sch B灌胃联合高糖高脂饮食时可同时升高血清TG和总胆固醇(total cholesterol,TC)水平可用于制备混合型高脂血症动物模型[19]。

果糖水和食用油灌胃可通过扰乱机体饮食平衡而达到迅速升高血脂的目的,造成急性HTG的机制与人类较为接近,但其高TG状态维持的时间较短,适用于做口服脂质耐受性测试(OLTT),对于评估肠道及全身脂质代谢具有重要意义。Ochiai等[20]给高脂饲料喂养1周后的雄性ddY小鼠在禁食12 h后灌胃大豆油(5 mL/kg),可在2～3 h内迅速升高小鼠血清TG(400 mg/dl)水平,并于6 h后恢复至正常水平。石慧荣等[21]用高蛋白低碳水化合物饲料(基础饲料31.3%,干酪素50%,L-胱氨酸0.2%,玉米淀粉4.5%,蔗糖10%,大豆油4%)喂养雄性SD大鼠1周,禁食禁饮24 h后只予20%果糖灌胃,每次4 h,灌胃5次,于末次灌胃后8 h血清TG达高峰,约为正常饮食大鼠血清TG的2倍。

2 慢性HTG动物模型

慢性HTG动物模型的造模方法包括基因修饰法、高脂饮食喂养法和复合因素造模法。

2.1 基因修饰法

国内外多使用基因修饰法研究基因缺陷导致的家族性高甘油三酯血症 (familial hypertriglyceridemia,FHTG)。LPL,载脂蛋白C2(apolipoprotein C2,APOC2),载脂蛋白 A5(apolipoprotein C5,APOA5),脂肪酶成熟因子1(lipase maturation factor 1,LMF1),甘油-3-磷酸脱氢酶1(glycerol 3-phosphate dehydrogenase1,GPD1)和糖基磷脂酰肌醇锚定的高密度脂蛋白结合蛋白1(glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein binding protein 1,GPIHBP1)是导致严重HTG的六个经典基因[22]。

Weinstock等[23]研究显示,纯合LPL基因敲除的小鼠幼崽TG水平是对照组的3倍,VLDL-C水平是对照组的7倍,其无法在哺乳期存活,会在出生后18～24 h内死亡。杂合LPL基因敲除小鼠可存活至成年并有轻度高甘油三酯血症,与对照相小鼠相比,进食或10%蔗糖饮食,TG水平会升高1.5～2倍。这可能与LPL血清TG清除速率降低,VLDL部分分解代谢率降低有关。Yang等[24]通过对GPIHBP1基因修饰,复制了HTG C57BL/6小鼠模型并探讨了HTG对AP细胞修复再生的影响。Liu等[25]通过转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技术突变了斑马鱼的APOC2基因,获得了严重的HTG和乳糜微粒血症动物模型。Wei等[26]开发了在肝和肠道中表达人APOC3的转基因猪,这些动物的血清TG水平可增加2.5倍,但总胆固醇和HDL-C水平正常。它们表现出延迟的TG吸收和清除,这与APOC3在阻碍TRL分解代谢中的已知作用是一致的。Gao等[27]通过对APOC2基因敲除的仓鼠连续静脉注射正常仓鼠血清而提高了新生儿仓鼠的存活率,并发现在后期可表现出严重的HTG,创建了一种具有严重HTG的新型ApoC2缺失哺乳动物模型。Takanashi等[28]使用APOA5基因敲除小鼠联合高碳水饮食喂养,成功地重构了人类APOA5缺乏症引起的严重HTG,而这种基因功能缺陷型的HTG会因高碳水化合物饮食或衰老等环境因素的刺激而加剧。Toshihiro等[29]研究发现一种APOC2的模拟肽可以逆转APOC2基因突变小鼠的HTG,可作为一种潜在的新疗法用于治疗APOC2缺乏症。

基因修饰法的优点是可以很好地模拟在遗传条件下HTG的发生、发展过程,是FHTG较理想的造模方法。缺点是成本高、技术难度大,且来源珍贵,无法大范围推广使用。

2.2 高脂饮食喂养法

高脂饮食喂养法是指用高TC、高TG的饲料进行喂养,导致实验动物血清脂质升高,造成脂代谢紊乱的一种造模方法。

大鼠和小鼠是最常见的建立高脂模型的实验动物,但大鼠、小鼠对高脂饲料不敏感,单纯高脂饲料喂养还会造成动物厌食的情况,而且饲料喂养不能保证实验动物的进食量相等,在后期指标检测时会影响结果的准确性。且大鼠和小鼠的脂质分布与人类的脂质分布不同,其体内主要以HDL为主,血浆TG的清除率比人大很多[30]。适合高脂饲料喂养的实验动物主要是豚鼠和仓鼠。豚鼠和仓鼠对高脂饲料极为敏感且脂代谢方式与人类相似,其大部分循环胆固醇和人类一样,都是通过LDL转运的[31]。仓鼠容易因膳食胆固醇摄入过多而引起高胆固醇血症[32],而豚鼠摄入高脂饲料易引起血清TG升高,且运动训练会降低豚鼠血清TG并增加血清HDL[33],与人类脂质代谢方式极为相似,是较理想的HTG动物模型。

有研究发现,给予雄性Hartley豚鼠和雄性Wistar大鼠相同配方的高脂饲料(0.1%胆固醇、10%猪油)的高脂饲料,豚鼠形成了典型的高脂血症及高甘油三酯血症动物模型,大鼠血脂未发生改变,而肝脏发生了明显的脂肪性病变[34]。由此可见,豚鼠更容易出现血脂升高,而大鼠更易诱发形成典型的脂肪肝模型。刘伟[35]还发现延长光照时间可以加重雌性豚鼠的胰岛素抵抗,加速糖、脂代谢紊乱的形成。这与长期熬夜、倒班及作息不规律的人群易患糖尿病、肥胖、高血脂等相关疾病密切相关。不足之处是豚鼠价格较贵,灌胃较困难,且成年豚鼠体重较大,操作较困难。因此,目前国内外学者选用豚鼠作为HTG动物模型的频率一直不如大鼠。

2.3 复合因素造模法

复合因素造模法是指在高脂饲料喂养的基础上增加其他干预方式(如添加高糖饮食喂养或脂肪乳剂灌胃、饮酒等)的一种造模方法。研究表明,蔗糖有利于肝脂肪酸酯化,促进TG-VLDL合成;果糖会减弱VLDL-TGs的分解代谢,引起TG大量沉积[36]。脂肪乳剂灌胃法可通过模拟人类的高脂饮食,使模型体内相关生化指标迅速上升,具有操作简单、造模时间短、死亡率低等特点[37]。复合梯度饮酒模拟了人类“过食肥甘醇酒”的饮食特点,其升高血脂的主要机制可能有:(1)乙醇抑制PPARα,阻滞脂肪酸(fatty acid,FA)氧化及转运。(2)乙醇抑制AMPK,减少FA氧化,增加FA合成[38]。单纯的高脂饲料喂养很难建立HTG动物模型[39],但若在高脂饲料喂养的同时添加高糖饮食或脂肪乳剂灌胃、饮酒等复合因素,造模会相对容易成功。

马文静[40]使用含10%牛油、20%蔗糖和10%果糖的高糖高脂饲料成功建立了HTG动物模型,可使模型组雄性SD大鼠血浆TG升高298%,并稳定持续10周左右。孙赫等[41]用正常基础饲料喂养配合10 mL/kg剂量的高脂乳剂(吐温60%、食用油15%、胆固醇6%、胆酸钠2%、丙基硫氧嘧啶0.2%)给雄性SD大鼠灌胃,并在造模前一次性腹腔注射维生素D3 60万单位/kg,仅10 d便可使大鼠TG升高3倍,且稳定性较高。杜宇忠等[42]用高糖高脂饲料(20%蔗糖、15%猪油、0.8%胆固醇、0.2%胆酸钠、适量的酪蛋白、磷酸氢钙、石粉等)加不同梯度的酒精喂养,自由饮食饮酒,4周后可使模型组雄性SD大鼠TG显著升高150%左右。灵长类的脂质代谢机制与人类最为接近,可用于评估血脂异常的临床前研究。Butler等[43]通过给成年雄性恒河猴喂养中脂饮食(约23%kcal)和高果糖玉米糖浆500 mL,可在1个月后使其空腹血清TG增加3倍多,较好地复制了恒河猴HTG动物模型。

值得注意的是,高脂饲料并不能成功诱导小鼠慢性HTG,这可能是由于外源性TC的大量摄入抑制了小鼠内源性TG合成,或同时抑制了TG从肝向血液的释放[44]。国内外学者常用载脂蛋白E基因敲除(ApoE-)和低密度脂蛋白受体敲除(low density lipoprotein receptor,LDLR-)的C57BL/6小鼠联合高果糖饮食诱导HTG。Mastrocola等[45]研究证明,喂养高果糖饮食的LDLR-C57BL/6小鼠可比喂养高脂饮食的C57BL/6小鼠血清TG增加2倍多。

3 先天性HTG动物模型

常见的先天性HTG动物模型主要有大鼠和兔。Kune等[46]的研究表明,遗传性HTG大鼠(hereditary hypertriglyceridemic rats,HHTg)有高血压和高血清TG,但不升高血清TC,而且这种脂质代谢紊乱还与血小板聚集密切有关。Mangat等[47]的研究表明,成年的雄性JCR:LA-cp大鼠正常饮食的情况下其血清TG水平即为正常大鼠的3倍左右,这主要是因为成年雄性JCR:LA-cp大鼠肝会分泌过多VLDL,从而表现出高瘦素血症、高胰岛素血症和明显的HTG。“watanble heritablehyperlipidemic rabbit”(WHHL)兔的LDL受体先天性缺陷,从出生时就表现为高胆固醇血症和HTG,是作为脂质代谢、动脉硬化不可多得的模型[8],已被世界各地广泛应用于研究。Kawai等[48]的研究发现,WHHL兔与日本白兔(Japanese white rabbit,JW)的杂交可形成餐后 HTG兔模型(postprandial hypertriglyceridemic rabbit,PHT),即在喂食标准饮食的情况下,血清TG水平就非常高。此外,圣托马斯医院(the St.Thomas Hospital rabbit,STH)兔表现出孟德尔形式的高甘油三酯血症,伴随着APOB脂蛋白生成增加和动脉粥样硬化加速[49]。

4 总结

建立科学有效的实验动物模型是整个实验研究的关键环节。现本文根据时间分类以及常见动物种类(见表1)对HTG动物模型做一概述,可根据不同的实验目的和实验能力,选择最理想的动物模型。急性HTG动物模型造模方便,用时短,TG升高明显,可用于降脂药物的初步筛选和验证;基因修饰HTG动物模型和先天性HTG动物模型可模拟遗传条件下HTG的发生、发展过程,是FHTG最理想的造模方法,可用于HTG发病的深层机理探索;高脂饮食喂养法和复合因素造模法与HTG发病机制最相似,与临床特征最吻合,可用于HTG的机制研究和药效评价。目前,HTG的造模方法还十分有限,本文对现有造模方法做一概述,以期为今后HTG的药效筛选和机制研究提供模型参考。