抽动障碍免疫相关动物模型研究进展

张晓蒙马丙祥周荣易史文丽李华伟

(1.河南中医药大学,郑州 450000;2.河南中医药大学第一附属医院,河南省中西医结合儿童医院,郑州 450000)

抽动障碍(tic disorders,TD),又称抽动症,是一种常发生于儿童期的以肌肉的不自主、突然、快速的收缩和(或)发声为主要表现的神经发育障碍性疾病,国内发病率约为6.1%[1]。TD常共患强迫症、注意缺陷多动障碍、情绪障碍、焦虑障碍等其他疾病[2],严重影响儿童的生活质量及心理健康,因此加强对本病的研究意义重大。截至目前,TD的病因及发病机制尚未完全阐明,目前的研究多集中在基于皮质-纹状体-丘脑-皮质(cortico-striatothalamo-cortical,CSTC)回路的多巴胺(Dopamine,DA)和5-羟色胺(serotonin,5-HT)等神经递质失衡并开发出相应的药物,取得一定的疗效,为TD的临床控制提供药物选择。但在临床治疗中,越来越多学者发现药物治疗TD无法有效控制其症状反复,TD的复发成为临床难题,而其复发或加重常常会在上呼吸道感染、免疫功能低下等的情况下出现,这引起人们的高度重视。随着TD与链球菌感染关系的相关报道[3]不断增加,TD存在的自身免疫异常受到广泛关注。国外研究发现TD存在一些抗体、免疫细胞、细胞因子、免疫球蛋白等异常及免疫相关的遗传学改变[4],免疫炎症发病机制成为TD病因及发病机理研究的国际前沿热点。

为研究TD的免疫炎症机制,国际上大量针对TD的免疫相关动物模型应运而生。纵观国内研究,学者多关注于感染、免疫因素与TD临床症状的严重程度的关联性研究,对抽动症免疫机制的实验研究涉及较少。动物模型是开展实验研究的基础,作为国际新兴的研究热点,对TD免疫相关动物模型的研究有助于深入探索其发病机制,解答临床疑惑,而国内尚未见有关TD免疫相关模型的详细报道。为详细了解TD免疫模型的国际研究情况,推动国内TD免疫发病机制研究的进展,本文系统总结了目前国际上针对TD免疫异常的模型研究,详细分析各种免疫模型的比较优势,以期为国内TD临床前实验研究提供模型参考。

1 细菌抗原或病毒模拟物诱导的主动免疫模型

早在20世纪90年代已有研究表明部分儿童在A组链球菌(group A Streptococcus,GAS)感染后出现急性抽动障碍,并提出了儿童自身免疫性神经精神疾病(pediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infection,PANDAS)的概念[5]。研究显示TD患者似乎更容易受到GAS感染,并产生较强的体液免疫反应,导致症状加重[6-7]。GAS感染可激活机体的自身免疫反应,增加血脑屏障通透性,GAS诱导的抗体靶向作用于大脑中负责控制运动的神经元,促使抽动症状的出现[8],且抗GAS抗体滴度与TD严重程度成正相关[9],因此产生了用细菌抗原或病毒模拟物来诱导自身抗体生成并发生相应免疫病理改变的主动免疫模型。

1.1 GAS感染相关模型

GAS感染模型为最早建立的TD免疫模型,通过将含有GASM6型匀浆的弗氏佐剂对雌性SJL/J小鼠皮下注射建立A组乙型溶血性链球菌(group A β-hemolytic streptococcal,GABHS)免疫的小鼠模型,这些小鼠在野外试验和洞板试验中有更高频率的直立行为。经检测发现一些GABHS免疫小鼠对深部小脑核(deep cerebellar nuclei,DCN)、苍白球和丘脑这些与感觉运动和情绪处理相关脑区域具有免疫反应性,并且在DCN中有免疫球蛋白IgG的沉积[10](见表1)。与GAS M6诱导的小鼠模型相似,使用含GASM18菌株成分的弗氏佐剂对雄性幼年大鼠进行免疫,并腹腔注射加热灭活的百日咳杆菌作为附加佐剂建立GASM18诱导的大鼠模型,大鼠的运动症状及强迫行为增加,并产生抗微管蛋白抗体,使钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II信号增强,在大鼠的纹状体、丘脑和额叶皮层中有抗体沉积,且伴随着皮层和基底神经节中多巴胺和谷氨酸等神经递质水平的变化,而治疗TD的药物氟哌啶醇、帕罗西汀可使异常行为缓解[11](见表1)。

GAS感染诱发自身免疫抗体激活导致了大鼠出现TD样行为异常,成为TD免疫发病机制的重要佐证,但在建模过程中如何破坏了血脑屏障的完整性使抗体通过血脑屏障并作用于相关脑区域仍缺乏相关的研究证据。对于该模型未来的研究可关注影响血脑屏障完整性的因素、抗体进入大脑的途径及如何发挥生物学作用。

1.2 其他微生物感染模型

GAS诱导的TD模型的建立为感染诱发机体免疫反应动物模型的设计提供了思路,多种微生物感染TD模型被制备出来,它们极大推动了TD免疫机制研究进程。有学者通过注射病毒模拟物poly(I:C)来刺激怀孕小鼠建立母体免疫模型,其后代在大理石掩埋实验表现出类似于TD的重复、刻板行为及理毛行为增加[12],且后续研究指出产前免疫激活导致了其后代出生后持续的免疫改变,主要表现为调节性(Treg)T细胞缺陷和CD4(+)T细胞反应升高,以及脾Gr-1(+)细胞水平升高,CD4(+)T细胞反应升高导致白细胞介素IL-17、IL-6增加,这些改变可进一步引起异常行为的发展或持续[13](见表1),且当消除IL-6后其后代行为异常也减少,因此可能IL-6发挥了主要作用[14]。研究显示,早期各种内源性或外源性因素引起的免疫激活可能在生命早期阶段启动神经网络的发展和突触的形成,并在生命后期形成免疫和内分泌组织与神经系统的交互作用[15]。因此,免疫模型具有一定的子代遗传特性。

表1 细菌抗原或病毒模拟物诱导的主动免模型Table 1 Active immune model induced by bacterial antigens or virus mimics

2 血清抗体直接输注诱导的被动免疫模型

血清抗体注射为TD免疫模型的另一种造模方法,该模型是将TD患者的血清抗体直接输注到大鼠或小鼠体内,作用于其脑组织从而引起模型鼠脑功能的改变导致类似于抽动行为的发生。该方法制备的动物模型生物学改变与细菌抗原诱导的主动免疫模型相似,研究显示,血清抗体注射与脑中的分子靶向补体C4蛋白和α-2-巨球蛋白发生交叉反应并产生免疫沉淀是该模型成功的基础[10]。

2.1 中枢(纹状体)注射血清抗体模型

研究显示TD患儿存在抗纹状体神经元抗体,抗体与纹状体神经元结合可引起纹状体功能障碍从而诱导行为异常[16]。实验研究显示,TD患者血清中的抗体可激活大鼠脑组织中超极化激活的环核苷酸通道 4(hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide channel 4,HCN4),调控CSTC回路的神经信号转导平衡为该模型发病的基础[17]。将含有高水平的抗神经元或抗核抗体(anti-nuclear antibody,ANAb)的TD患者血清注射到大鼠的腹侧纹状体,发现大鼠的口腔刻板行为增加[18],国内亦有与之类似的研究可复制TD的抽动症状[19]。且纹状体输注TD血清后,SD大鼠表现出更多的刻板行为,这些行为与输入抗HCN4抗体的量相关[17](见表2)。

2.2 外周注射血清抗体模型

外周注射血清抗体模型造模思路及方法与中枢注射模型类似,且具有一定的验证效应。研究显示,通过向雄性成年BALB/c小鼠皮下注射抗GAS IgM单克隆抗体,小鼠嗅探行为、头部摆动和理毛行为增加,诱发受体小鼠出现抽动行为,这与抗GAS IgM抗体调控皮质-纹状体投射相关的区域引起了Fos样免疫反应有关[20],另外直接输注被含GABHS匀浆免疫过的小鼠血清也可产生与注射TD患者血清相似的效应,而清除供体血清中IgG则此行为改变消失[21],这些有力验证了TD自身免疫发病机制的存在(见表2)。

表2 血清抗体直接输注诱导的被动免疫模型Table 2 Passive immune model induced by direct infusion of serum antibodies

续表2

3 直接注射免疫因子模型

前瞻性研究表明,TD患者体内IL-12和肿瘤坏死因子TNF-α水平较高,且在症状加重期间进一步升高,这表明TD症状加重可能与涉及中枢神经系统的细胞因子诱导的炎症过程有关[22]。研究结果显示,促炎细胞因子可调节多种神经传导,如谷氨酸能、γ-氨基丁酸能、多巴胺能和去甲肾上腺素能神经传导,从而引起神经胶质网络的改变和神经精神异常的后果[23]。因此细胞因子不仅具有免疫调节作用,而且还具有调节神经活动的作用,一些神经精神疾病的细胞因子的异常可能与此有关,已有实验证实通过注射细胞因子或其受体可诱导TD免疫相关模型。

3.1 注射IL-2和IL-6模型

IL-2是一种外周免疫细胞以及中枢神经系统驻留细胞产生的细胞因子,研究显示,IL-2可诱导活化T细胞的增值并影响Treg细胞的存活,在激活自身免疫应答的同时,影响中皮层皮质结构中DA的释放。临床研究发现一些TD患者存在Treg细胞缺乏而抑制自身反应性淋巴细胞能力下降的现象[24]。通过向妊娠中期至晚期的自身免疫性疾病敏感的SJL/J小鼠注射IL-2,IL-2可穿过胎盘并导致后代长期持续的T细胞发育加速且倾向于产生促炎Th1型细胞的免疫紊乱及旷场活动、理毛和直立行为增加等行为异常[25](见表3)。而向雄性BALB/c小鼠腹膜内施用IL-2,不仅导致前额叶皮质的DA转换更高,而且还会增加海马和下丘脑中去甲肾上腺素的利用率,同样注射IL-6也可获得类似的结果[26](见表3)。因此导致后代行为异常的主要过程可能为母体的免疫反应,而不是胎儿的直接感染。

3.2 注射可溶性IL-2受体(sIL-2R)和可溶性IL-6受体(sIL-6R)模型

可溶性细胞因子受体是缺乏膜结合受体的正常体液成分,可溶性细胞因子受体作为细胞因子和淋巴细胞活性的调节剂起重要作用,在一些自身免疫病症和精神病症中细胞因子受体增加,它们可以在与免疫激活有关的疾病中充当疾病活动的重要生物标记。向BALB/c雄性小鼠单次皮下注射sIL-2Rα或β,其头部运动、理毛、直立、嗅探等刻板行为增加,且伏隔核和前额叶皮层的c-Fos表达增加,Fos样免疫反应的分布和sIL-2Rs的沉积部位相似,sIL-2Rs可能充当新型的脑免疫信使,促进了神经精神病的疾病进程[27]。此外,可溶性sIL-6R水平也与某些自身免疫性疾病和精神疾病的疾病进展呈正相关,在雄性BALB/c小鼠中注射重组人sIL-6Rα后刻板行为和探索性运动行为增加,注射的sIL-6R主要定位于与CSTC回路相关的脑区,在伏隔核、尾壳核、运动皮质、丘脑核中与IL-6跨膜信号蛋白gp130共定位;实验证实外源性sIL-6R可能作为一种神经免疫信使,穿过血脑屏障靶向作用于富含IL-6反式信号蛋白的CSTC电路,并诱导重复刻板行为的产生[28](见表3)。

表3 直接注射免疫因子模型Table 3 Direct injection of immune factors model

4 免疫相关的转基因及特定小鼠品系模型

抽动障碍的发病机制明显受到遗传因素的影响,已报道有多个候选基因与抽动障碍相关,且已经开发了几个相应的基因敲除突变小鼠品系模型,如多巴胺转运蛋白基因敲除模型、单胺氧化酶A基因敲除模型等[29]。其中一些转基因及特定小鼠品系,如 Hdc基因敲除(Histidine Decarboxylase Knockout,Hdc-KO)小鼠、BTBR T+tf/J小鼠品系等,因存在TD样行为异常及相关免疫异常,也可作为TD免疫相关模型研究。

4.1 Hdc基因敲除小鼠模型

组氨酸脱羧酶是组胺生物合成的关键酶,在人体中组氨酸脱羧酶由Hdc基因编码,Hdc-KO小鼠无法合成组胺,其抽动样刻板行为明显增加,并且纹状体中多巴胺增加及细胞内信号转导改变,通过在大脑注入组胺、氟哌啶醇可使刻板行为减少,且组胺输注可降低纹状体DA水平[30]。最新的研究表明组胺生物合成的破坏可能通过影响小胶质细胞的功能与TD的发生相关:小胶质细胞是中枢神经系统的主要固有免疫细胞,可产生并分泌细胞因子来参与调节炎症和免疫反应,以及细胞生长、存活和分化,介导神经炎症并调节大脑发育[31-32],Hdc-KO小鼠组胺缺乏导致纹状体和下丘脑小胶质细胞的分支减少,表达胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)的小胶质细胞减少,因表达IGF-1的小胶质细胞具有神经保护作用并限制炎症反应,故将导致对炎症激发反应的过度敏感,如对脂多糖的反应增强[33],因此Hdc敲除可能引起小鼠大脑过度免疫炎症促发了TD样改变。

4.2 BTBR T+tf/J小鼠品系模型

BTBR T+tf/J小鼠是一种近交系小鼠,常作为孤独症谱系障碍模型[34],但与TD模型中描述的免疫和行为障碍有重合之处,都描述了某些重复刻板行为增加,对比C57BL/6J小鼠及BTBR×C57BL/6J F1代小鼠,其大理石掩埋和理毛行为增加,使用多巴胺D2受体拮抗剂氟哌啶醇及选择性5-羟色胺再摄取抑制剂帕罗西汀可使异常运动减少[35],研究测定BTBR小鼠在没有特定的环境暴露影响下血清IgG和IgE,IgG抗脑抗体,沉积在大脑中的IgG和IgE的含量明显增高,细胞因子IL-1β,IL-18,IL-33升高,且分泌IgG的B细胞数量也增加[36],这些与主动免疫模型产生的生物学效应类似,表明该品系小鼠本身也可作为TD动物模型。

5 其他免疫相关模型

1-2,5-二甲氧-4-碘苯-2-氨基丙烷(1-(2,5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane,DOI)诱导的大鼠模型为国际上常用的TD模型,实验证实该模型血清和纹状体的IL-6、IL-1β和TNF-α明显升高,且天麻素和硫必利可减少DOI大鼠血清和纹状体中的炎症因子,显著改善大鼠行为学改变,并抑制纹状体TLR/NF-κB和TLR/MAPK信号通路的激活,而NF-κB是最重要的调节蛋白,参与细胞存活、免疫反应和炎症反应等细胞生命活动,TLR2和TLR4与炎症密切相关[37],并且脂多糖可加重DOI诱导的小鼠模型的刻板行为及炎性细胞因子水平,可能与TD的复发有关[38],因此可作为研究TD免疫学变化及治疗药物的模型。

6 讨论

TD免疫动物模型的验证亦基于目前人类疾病动物模型评价的3个因素:(1)表观效度为TD临床症状与动物模型行为表现之间的现象学相似性;(2)预测效度是指对经过验证的治疗抽动障碍药物的反应性;(3)结构效度是指基于已知的TD疾病病理生理学的理论基础,用于评估抽动障碍的病因学和病理生理学过程与动物模型中行为表现的神经生物学基础之间的一致性[29,39]。以3种效度作为评价现有TD免疫模型优势与不足的标准:从表面效度而论,各种免疫动物模型都可模拟人类TD某些症状,具有一定的表面效度,但由于TD患者的表现复杂多样,而动物模型的行为学表现谱较为狭窄,故不足以全面模拟TD患者的临床症状,多数免疫模型主要表现为自主活动如直立或理毛行为增加,可模拟患者的全身性抽动,而直接注射抗体模型异常行为的表现形式更为多样,如舔舐、自咬、啃食等口腔刻板行为明显增加,可模拟患者的口腔部位抽动甚至发声性抽动,注射细胞因子受体模型可见到头部运动的增加,可模拟人头部抽动症状。对于结构效度,目前TD的免疫生理病理机制仍未阐明,故免疫模型的结构效度欠佳,但已有学者提出了GAS感染后产生了抗神经元的交叉反应性抗体[8]或大脑固有免疫细胞小胶质细胞异常[40]与TD发病密切相关的猜测和假说,就此而言GAS感染模型和Hdc-KO模型相对具有一定的结构效度,而相对于GAS抗原主动免疫产生特异性抗体而言直接注射抗体的模型缺乏针对性,结构效度较弱,但随着研究的不断推进免疫机制不断被阐释,免疫模型或将具有良好的结构效度。对于预测效度,目前较多的临床实验已证实TD患者存在各种免疫异常,且已有研究表明通过免疫调节剂匹多莫德[41]或抗生素头孢地尼治疗[42]可减轻TD症状,因此针对TD免疫异常的治疗方法及药物也会顺势而生,免疫动物模型将具有良好的预测效度,未来的研究可关注于抗炎或抗生素等药物对TD免疫系统的作用及治疗反应。另外从技术层面而言,GAS主动免疫模型造模方法相对较为成熟,模型可复制性强,但抗原制备过程稍复杂;直接注射抗体模型造模方法相对较为简单,但对技术的要求较高,对鼠脑解剖学要熟知,且操作不当可引起脑部感染,对实验结果的影响因素较多;转基因模型虽靶点精确,但操作较为复杂,价格昂贵,不易制备。总体而言,TD相关的免疫动物模型研究仍处于初始阶段,由于对PANDAS的研究较多,其中的GAS抗原主动免疫模型较为成熟,可促进TD感染相关临床问题的解决及自身免疫机制的阐明,且异常行为持续时间较长,有利于研究进行。免疫相关的TD动物模型重现了一些类似人类TD的异常行为,且动物模型出现的多种行为异常和大脑变化与人类TD研究中报道的发现高度相关,证实了TD患者中存在免疫异常的假设,故推测免疫模型或将成为一种良好的模型。

通过免疫相关模型研究的最新进展,捕获有特定免疫改变的动物模型有望为制定TD的有效治疗策略及开发和验证新型药物提供实验平台,未来的研究应关注和确定这些疗法的机制,并明确适用于哪些TD儿童;同时免疫相关的动物模型也可为未来TD免疫机制的阐明提供基础;对于其免疫机制研究或将明确一些生物标记物,如抗体、细胞因子等改变,由于这些免疫因子的可检测性,对于本病的诊断或预后可提供一定的参考。且模型动物均以服务显示研究为根本研究目的,就目前研究来看,神经-免疫相互作用的病因及发病机制在TD的研究地位日渐突出,临床上的人体学研究均显示免疫因素在TD发病学中的特殊重要地位,因此免疫相关模型具有超前的预测效度和结构效度,能够指引未来科研的发展,应受到重点的关注。