阿尔茨海默病实验动物模型评述

李少创韩诚*秦亚莉赵雅飞魏文一杨杰帅月圆郭栋

(1.山西中医药大学,山西 晋中 030619;2.中医脑病山西省重点实验室,山西 晋中 030619)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种病因尚不明确的认知和记忆功能逐渐丧失的不可逆转的神经变性类疾病,多发于老年人群。据统计全球约有5000万AD患者[1],中国的患病情况亦不容乐观。据推测,随着中国老年人口的快速增加,未来20年中国的痴呆患者将大幅增加[2],这会极大的增加中国家庭和医疗系统以及社会的负担[3]。

AD患者可表现出进行性记忆减退,执行功能受损,日常活动困难,思维和行为方式改变,以及语言功能损害等临床症状[4]。AD的特征性病理表现为由神经元外蛋白质片段——β淀粉样蛋白(βamyloid,Aβ)的异常聚集,神经元内Tau蛋白的异常积累,神经胶质增生和神经元丢失导致的大脑萎缩[5],同时伴有脑血管淀粉样变性,炎症和重大突触改变等[6-8]。面对这一种破坏性较强的退行性神经疾病,其复杂的病因和病理变化,以及严重的社会危害性,对临床医生和科研工作者提出了重大挑战,而实验动物模型的正确选择则是解决这一难题的前提条件。本文通过总结当前各类AD实验动物模型的建立方法,针对其优势、适用条件和不足进行了详细评述,以期为研究者选用和建立实验动物模型提供可靠的参考依据。

1 实验对象的选择

人类和动物在生理上有极大的相似性[9],因此可以通过在动物身上模拟构建各类疾病模型,探索疾病的生物学机制,验证相关治疗方法的有效性。目前,用于制备AD模型的动物包括黑腹果蝇[10]、秀丽隐杆线虫[11]、斑马鱼[12]、小鼠、大鼠、犬[13]、恒河猴[14-15]和黑猩猩[16]等。实验动物在种属和生理条件上不尽相同,因此研究者可以根据所要研究的疾病机制和需要模拟的神经病理变化来选择合适的实验动物(见表1)。

表1 AD实验动物的选择Table 1 Selection of AD experimental animals

续表1

2 实验动物模型的构建

由于阿尔茨海默病发病机制尚不明确,学者围绕AD患者临床表现出的衰老特征和该疾病所特有的病理特征来进行合理推测并提出了众多发病假说,AD模型的构建思路即是以各种假说为依据的。目前尚未真正模拟出与AD患者所有病理特征完全相符的模型,一方面,阿尔茨海默病的病理特征呈现出多样性特点;另一方面,动物和人类在生理上相似度虽然很高,但二者之间仍存在着一些差异。此外,动物模型设计的充分性、合理性会极大程度的影响受试药物效应的可靠性,进而影响将科学研究成果应用于临床。

因此,选择合适的实验动物模型是解决这一难题的前提条件。目前,可用的AD动物模型包括:自然动物模型、人工干预动物模型、遗传动物模型、其他动物模型。

2.1 自然动物模型

年龄是AD发病的重要危险因素之一[17]。自然动物模型以高龄老化作为AD的发病基础,可自发形成。一方面符合衰老或老化生理特征,另一方面无需人为干预,减少了人为因素参与所产生的误差,主要包括自然衰老模型和快速衰老模型。

2.1.1 自然衰老模型

衰老过程在动物(如啮齿类动物和犬科动物,以及非人灵长类动物)和人类所表现的体征(如认知功能下降、记忆能力衰退)比较相似[18]。该模型不需要干预因素,可自发形成,模型动物的老化症状与AD患者相似。但此类动物不会自发地形成AD典型的病理特征(如淀粉样蛋白沉积),可以用于开展生理性老化与AD之间关系的相关研究[19-20]。常用的衰老动物为小鼠和大鼠,小鼠衰老期在12～24月龄,大鼠衰老期在21～32月龄[21-22]。但是,由于造模周期较为漫长,受试动物很可能会在衰老过程中变生其他疾病或死亡,导致动物个体之间差异性增大或组内动物数量减少,最终导致实验失败。

2.1.2 快速衰老模型

此模型最早由日本京都大学Takeda等[23]培育出来,并将其命名为快速老化小鼠(senescenceaccelerated mouse,SAM),包括快速衰老系P系(SAMP)和正常衰老系R系(SAMR)。P系小鼠的衰老进程明显加快,可作为研究衰老相关机制实验的受试动物。R系保留了动物的正常衰老特性,可作为P系实验动物的对照样本。SAMP系小鼠可表现出AD特有的Aβ聚集、tau蛋白异常过度磷酸化、神经元丢失等病理改变[24]。SAMP系当中的SAMP8小鼠由于老化迅速和AD病理特征性改变发生早的特点,受到很多研究者的青睐,是较为理想的动物模型。

2.2 人工干预模型

2.2.1 物理干预模型

以AD疾病发生病理假说为基础,采用各种物理干预手段对实验动物进行干预,来制备相应动物模型。具体建模方法见表2。

(1)胆碱能损伤模型

胆碱能损伤假说认为,AD痴呆的严重程度与胆碱能神经元丧失的程度呈正相关性[25-26]。并且认知功能的正常与否依赖于足够的胆碱能神经传递[27],乙酰胆碱作为重要的神经递质之一,其在脑内神经元含量的减少,会引起认知和记忆能力的下降。一方面,在AD患者大脑中存在着广泛的神经元和突触缺陷,其中基底前脑神经元的退化在很大程度上影响了神经递质传递的有效性,从而导致AD认知能力的下降[28]。另一方面,乙酰胆碱脂酶活性增强,加速乙酰胆碱的分解,并且胆碱乙酰转移酶活性降低导致乙酰胆碱合成减少[29],更加剧了乙酰胆碱的匮乏程度,导致神经元之间的传递障碍,最终发展为AD[30]。

本方法通过手术损伤海马伞的方法,造成动物胆碱能系统损坏、动物空间定向困难和记忆缺陷,进而制备胆碱能损伤模型[31-32]。

(2)颈总动脉结扎模型

研究表明,老年人脑血流量减少、血流减慢,脑部神经元长期处于慢性缺血缺氧状态,随时间延长,出现认知记忆障碍等AD病理特征表现[33]。

通过结扎受试动物颈总动脉来建立AD模型,包括单侧颈总动脉永久性结扎法[34]、双侧颈总动脉永久性结扎法[35-37],另有一侧颈总动脉闭塞一侧颈总动脉的狭窄法、双侧颈总动脉狭窄法、不对称双侧颈动脉狭窄法[38]。此模型通过结扎颈总动脉使脑组织处于缺血状态,随后出现空间学习记忆障碍。

(3)化学干预模型

化学干预模型主要以AD疾病发生病理假说为理论基础,通过向动物脑部特定区域以及身体各部位(皮下、腹腔等)注射不同化学物质来模拟构建AD疾病模型。具体建模方法见表2。

表2 人工干预AD动物模型分类表Table 2 Classification table of artificial intervention AD animal models

续表2

2.2.2 Aβ注射模型

β-淀粉样蛋白沉积所形成的老年斑(senile plaques,SP)是AD病理特征主要表现之一。Aβ注射模型通过向脑内各区域注射不同长度Aβ多肽片段(Aβ1-42[39]、Aβ1-40[40]、Aβ25-35[41])来达到急性损伤,进而模拟构建AD模型[42-43]。

此模型需要35～42 d的时间,影响因素单一,且属于急性损伤,与AD慢性起病的特点不符。此外,Aβ容易停留聚集在注射部位,而不是像AD患者脑内的弥散状态。

2.2.3 鹅膏蕈氨酸注射模型

AD病理特征之一表现为明显的神经元缺失,引发认知和记忆的严重障碍。将鹅膏蕈氨酸(Ibotenic acid,IBO)注入与学习记忆强相关的Meynert基底核,模型动物表现为大脑内神经元缺失、Aβ蛋白沉积和Tau蛋白水平增加以及胆碱能系统损坏[44]。另有Aβ结合IBO共同使用来模拟AD模型[45]。

2.2.4 链脲菌素注射模型

向动物侧脑室注射链脲菌素(streptozotocin,STZ)来破坏脑部能量代谢,使动物出现相应的Aβ沉积、tau蛋白高度磷酸化、胆碱能功能异常、氧化应激等[46]。

STZ模型与AD许多病理特点相符,但此模型在注射STZ后要等待3个月后来观察AD病理特征[47],且动物死亡率较高[48]。

2.2.5 D-半乳糖注射模型

D-半乳糖(D-galactose,D-gal)具有还原性,会引发动物组织的氧化应激和炎症,进而导致神经元的衰老。

通过皮下注射D-gal来建立亚急性衰老模型,导致认知和胆碱能功能异常[49-50]。此模型造模相对简便,但大脑内不出现Aβ沉积等病理表现。

2.2.6 三氯化铝注射模型

金属元素在AD的发病中占有重要的作用[51]。此模型通过向小鼠腹腔注射三氯化铝来建立空间学习记忆损伤模型[52]。脑组织中高浓度的铝使Aβ聚集加快,神经元变性坏死,空间学习和记忆能力遭到损害[53]。此模型通过腹腔注射三氯化铝造成动物脑组织中Aβ增多以及神经元的变性,进而模拟AD病理特征[54]。

另有口服三氯化铝来构建AD疾病模型[55]。

2.2.7 冈田酸注射模型

冈田酸(okadaic acid,OKA)是蛋白磷酸酶选择抑制剂,在向受试动物脑内不同位置注射后会诱导Tau蛋白过度磷酸化[56]。

模型动物在OKA注射后可以诱导产生记忆损伤,tau磷酸化的增加以及特殊脑区中的β-淀粉样蛋白的形成[57]。

2.2.8 东莨菪碱注射模型

东莨菪碱(scopolamine,SCOP)为胆碱能拮抗剂,腹腔注射后可出现胆碱功能障碍和氧化应激[58]。此模型可以造成动物学习记忆障碍,但缺乏tau蛋白过度磷酸化和Aβ沉积等AD典型的病理改变。

3 转基因动物模型

转基因动物模型以遗传学说为其基础,将人或动物的疾病相关基因作为目的基因进行修饰,再拼接一个特定的启动子后植入动物(最常用为小鼠,少数为大鼠、果蝇、斑马鱼)受精卵内。再将受精卵导入假孕动物体内使其稳定遗传以复制AD特定病理特征。

研究表明,多个基因都与AD的发生有着密切的关系,主要有淀粉样前体蛋白APP、微管相关蛋白MAPT、早老素PSEN1、载脂蛋白APOE和髓系细胞-2上表达的触发受体TREM2,以及淀粉样蛋白原的剪切酶BACE1(β-分泌酶1)[59-61]。由于AD两个确定的病理标志是Aβ和tau,这些模型多专注于淀粉样蛋白,仅有少部分关注于tau。其中APP和PSEN1基因与Aβ的生成有关,APOE基因参与Aβ沉积形成过程。Tau基因突变可引发tau蛋白表达异常,进而出现tau蛋白异常磷酸化及神经缠结等AD病理特征。AD转基因模型主要包括APP转基因模型、Tau蛋白转基因模型、PSEN1转基因模型、APOE转基因模型、双转基因模型以及多转基因模型等[62]。具体建模方法见表3。

表3 常用AD转基因动物模型分类表Table 3 Classification of commonly used AD transgenic animal models

尽管许多转基因模型在评估新型疗法潜力方面的实用性上仍存在较大争议,但了解可用的不同模型并对其功能进行详细了解,可以帮助研究者选择最佳模型,以探索疾病机制或评估候选药物。转基因动物模型依然是目前AD模型中的主要模型,已为人类了解疾病的部分机制做出了巨大贡献,并且在以后的其他实验中可能会开创出疾病新的治疗方法。

3.1 APP转基因模型

Aβ沉积是AD病理改变的重要特征之一,APP作为Aβ的上游前体蛋白,影响着Aβ的产生。过量表达Aβ蛋白可以形成SP,影响着AD病理过程的发展。

此模型通过转染或敲除APP基因,促进动物脑内Aβ产生,进而表现出Aβ沉积的病理特征。但模型动物大脑区域中不会出现神经纤维缠结和明显的神经元丢失。

3.2 Tau蛋白转基因模型

Tau蛋白是一种细胞内被用作支架的微管相关蛋白,可以促进微管的聚集。其主要存在于轴突中,但体细胞和树突中也存在Tau蛋白。在病理条件下,Tau过度翻译表达以及异常修饰,尤其是过度磷酸化修饰,会影响其与微管结合的亲和力,进而导致Tau聚集性增强和清除率下降。

此类模型仿效了AD患者Tau蛋白异常修饰而被广泛应用,但不能用于模拟AD其他病理过程。

3.3 PS转基因模型

位于14号染色体上的PS-1基因和位于1号染色体上PS-2基因共同控制着APP剪切酶之一的γ-分泌酶复合物的形成。PS基因突变时会影响到γ-分泌酶复合物结构的稳定性,进而影响到下游APP的剪切过程。

PS1中的突变是家族性AD的最常见原因,但它们不会在转基因小鼠模型中形成淀粉样蛋白斑块。因此,PS突变常与APP或其他突变结合使用,来加强转基因后的协同效应。

3.4 双转基因模型

双转基因模型是在单转基因模型的基础上结合另外一种单转基因模型构建而成的。APP小鼠大脑皮层可形成老年斑,但几乎观察不到神经纤维缠结,为解决问题,人类的Tau和PS基因被引入到APP小鼠当中,建立出APP/Tau双转基因小鼠。

APP/PS双转基因小鼠通过加速表达Aβ,实现更快速且稳定地形成Aβ增多、聚集的病理特征表现。但这类模型与APP模型一样,无法形成Tau病理。而APP/Tau双转基因小鼠可同时出现Aβ斑块沉积和神经元纤维缠结。

3.5 多转基因模型

AD病理存在多种基因缺陷,单转基因模型或双转基因模型难以完全契合AD的全部病理特征。因此,研究者创建了多转基因模型来全面模拟AD的病理特征。

续表3

续表3

多转基因模型是根据需要将三个或三个以上易感基因结合在一起来建立基因模型。此类模型可以用于测试AD特定的病理分子机制或研究候选药物对特定病理的作用和疗效,也可用于比较两类转基因模型之间的差异。3xTg模型是典型的多转基因模型,同时具有APP、PS1、Tau三个基因突变。该模型可表现出Aβ沉积形成的斑块和tau病理改变,以及神经纤维缠结。

4 其他动物模型

除了自然动物模型、人工干预动物模型、遗传动物模型以外,研究者还基于近年出现的新的发病假说创建了相关动物模型。主要有自身免疫模型、人源肠道菌群动物模型。

4.1 自身免疫模型

AD的一个重要病理特征为Aβ蛋白在大脑和脑血管系统的沉积[94],AD神经变性严重程度与脑内Aβ抗体的水平密切相关[95]。动物实验证明主被动免疫疗法均能减少转基因小鼠的体内的Aβ含量并可挽救记忆缺陷[96]。于是研究者不再局限于研究淀粉样斑块沉积,而将研究视角聚焦于自身免疫层面。虽然免疫疗法也像动物实验一样可以降低患者体内的Aβ含量,但免疫疗法临床试验均未能改善患者的记忆力。

4.2 人源肠道菌群动物模型

随着这几年对肠道菌群的研究加深,越来越多的研究表明肠道菌群与AD的发生发展有着密不可分的联系[97]。因此,有研究人员将AD患者粪便的菌群提取液经口灌胃小鼠来制备人源肠道菌群动物模型[98]。该模型可以探索肠道微生物群对AD发病机制的远程贡献背后的特定信号介质或机制。

5 问题与展望

阿尔茨海默病已成为危害老年人的全球性疾病,受到了世界认知科学、神经科学、心理学等领域学者的广泛关注。目前常用的AD实验动物模型众多,表现出的疾病症状及病理改变各不相同,各种动物模型都有各自的长处与不足,因此需要根据疾病发生原理和实验目的不同选择相应的模型。

但是,即便AD的相关研究成果层出不断,为何至今仍然鲜有有效的治疗方法和手段问世。笔者认为,AD有效治疗方法开发的主要障碍是缺乏适当的模型,而构建恰当的疾病模型需要明确疾病发生的机制。AD发病机制尚不明确,未能形成定论或达成统一认识,模拟构建出完全符合疾病发病机制特点的模型似乎是遥不可及的。此外,AD是一种复杂的慢性神经退行性疾病,并且可能是人类所特有的,当前单一病因途径或单一致病因素的观点限制了AD在动物身上的模拟,以及动物模型的发展。就此,我们一方面需要在3R原则的指导下尝试开发新的实验动物种类;另一方面则可以从整合医学理念出发,从整体和宏观角度综合判别疾病发生机制和多靶点治疗途径,以拟定更加完善且符合疾病本质的研究方案和治疗手段。