中华绒螯蟹不同可食部位对恩诺沙星的富集效应研究
2022-03-24方龙香陈曦黄铢玉单祥保邢路畅张聪宋超1
方龙香,陈曦,黄铢玉,单祥保,邢路畅,张聪,宋超1,2,*
(1. 农业农村部水产品质量安全环境因子风险评估实验室,中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 江苏 无锡214081;2. 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室,北京100141;3. 南京农业大学无锡渔业学院,江苏 无锡214081;4. 江苏省常州市天宁区农业农村局,江苏 常州213000)
近年来,随着中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)养殖规模的扩大,集约化程度也越来越高,由此而引发的一系列细菌性疾病也日趋严重。恩诺沙星由于其抗菌谱广、杀菌和抑菌作用显著,而被广泛应用于中华绒螯蟹的养殖[1-2]。但是,由于养殖从业者科学用药理论缺乏,安全用药意识薄弱,在养殖过程中滥用抗生素,忽视了因抗生素滥用而引起的养殖生态环境的恶化和药物残留的问题,导致喹诺酮类抗生素在生物体内蓄积[3-5]。而且中华绒螯蟹由于其底栖的生活习性、移动缓慢、活动范围小以及滤食的特性,在污染环境中缺乏回避能力,所以体内易蓄积污染物质[6-7]。过量的抗生素不仅会使细菌产生耐药性,而且也会影响水产品的质量安全。
相关研究表明,在虾、鲤(Cyprinuscarpio)、鲑以及中华绒螯蟹等多种水产品体内的各个组织中检测到恩诺沙星的残留[8-10],含恩诺沙星的水产品被消费者食用后,由于其在人体内代谢缓慢,易蓄积在肌肉、肝脏等部位中,恩诺沙星在机体内的长期蓄积,可能会引起关节或者软骨损伤,还可能会引起泌尿系统、消化系统的损害,更严重可能导致神经系统的损伤[11-12]。
目前关于恩诺沙星在水产动物体内代谢情况的研究对象多为鱼类,少部分涉及虾类、中华鳖(TrionyxSinensis)等其他的水产动物[5, 13-15]。由于中华绒螯蟹肝脏组织的脂肪类化合物含量较高且成分复杂,极易干扰目标药物的检测,较少有关于中华绒螯蟹体内可食部位(蟹腿肉、蟹身肉、性腺和肝胰腺)恩诺沙星富集效应的研究[16]。本研究以中华绒螯蟹为研究对象,探究其在不同浓度恩诺沙星暴露下,药物在其体内不同可食部位的富集规律,以及性别差异对恩诺沙星蓄积的影响,并观察主要代谢产物环丙沙星的生成情况,为恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的分布、蓄积和迁移规律提供理论指导,进而为国内中华绒螯蟹的健康养殖以及质量安全提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 实验样品
实验所用的中华绒螯蟹于2019年10月中旬采集于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴生态养殖基地,将采集到的螃蟹暂养于玻璃缸(长39.50 cm×宽28.50 cm×高19.50 cm)中。暂养一周后,选择规格整齐、肢体健全以及无明显体表外伤的雌雄个体(公蟹初始平均体重约为120 g,母蟹约为90 g)各60只开始正式实验。
1.2 试剂及药品
甲醇、甲酸均为色谱纯(购于德国默克生物科学公司);提取液(0.1%甲酸乙腈溶液);Agilent Bond Elu EMR-Lipid增强型脂质去除净化管,EMR-Lipid Polish MgSO4(购于上海安谱实验科技股份有限公司);恩诺沙星标准品(纯度>99.9%,购于Dr. Ehrenstrofer GmbH),盐酸环丙沙星标准品(纯度>92.3%,购于Dr. Ehrenstrofer GmbH);0.1%甲酸水、0.1%甲酸甲醇、初始流动相(0.1%甲酸甲醇∶0.1%甲酸水=2∶8);HLB固相萃取小柱(上海安谱实验科技股份有限公司,60 mg/3 mL)。
1.3 仪器设备
超高效液相色谱/质谱(Waters,美国);多管式涡旋振荡器(Henry Troemner,美国);GL-22 MS高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);Talboys数显型多管式漩涡混合器(上海安谱科学仪器有限公司);Talboys基本型漩涡混合器(上海安谱实验科技股份有限公司);离心机(Sigma,德国);真空系统(Merck,德国);AL104分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。
1.4 实验设计
根据预实验的结果,暴露实验分别设置了空白对照组(0 μg/L)、低浓度组(50 μg/L)、中浓度组(500 μg/L)和高浓度组(5 000 μg/L)4个实验组,每个浓度组设置3个重复,公母蟹分开,共24个玻璃缸。每个玻璃缸中加入6 L水(养殖用水为户外曝气一周以上的除氯水),分别随机放入6只螃蟹。
在每个缸中放入增氧泵连续增氧,试验环境控温,温度保持在(23±1)℃,隔3 d换一次水,每次换完水都需要按照初始浓度重新添加药物,养殖周期共5周。在实验养殖期间,不投喂任何饲料,每天观察并记录各试验缸中螃蟹的打斗和伤亡情况。
1.5 样品采集
养殖周期为5周,从实验开始的第1天采集一次中华绒螯蟹样品,随后每间隔一周采集一次,在24个缸中分别随机挑选一只螃蟹,仔细冲洗螃蟹表面,减少表面药物残留。用剪刀去壳、去鳃后,将螃蟹的可食部位按照蟹腿肉、蟹身肉、肝胰腺以及性腺分装于离心管中,-20 ℃保存,待进一步处理。
1.6 样品前处理及测定
1.6.1 样品的提取
准确称取(2.00±0.01)g的样品于50 mL离心管中,加入10 mL的提取液(0.1%甲酸乙腈)振荡混匀,在2 000 r/min的速度下涡旋振荡10 min,10 000 r/min的转速下离心5 min;取离心后的上清液5 mL到已经用5 mL超纯水活化后的Agilent Bond Elu EMR-Lipid增强型脂质净化管中,2 000 r/min的速度下涡旋振荡5 min,在4 000 r/min的转速下离心5 min;将离心后的上清液全部转入装有1.7 g EMR-Lipid Polish MgSO4离心管中,2 000 r/min的速度下涡旋振荡5 min,在4 000 r/min的转速下离心5 min。取有机相(上层)过0.22 μm有机相滤膜于10 mL离心管中,若样品浓度较低时旋蒸浓缩后再上机;样品浓度较高时稀释至标准曲线浓度范围内再上机。
1.6.2 仪器操作条件
色谱条件:色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm,2.1 mm×100.0 mm,柱温设为40.0 ℃;样品室温度设为10.0 ℃;进样量为5.0 μL。梯度洗脱程序见表1。
表1 液相梯度洗脱程序
质谱条件:电喷雾离子源(ESI+),多反应监测模式(MRM)。毛细管电压为3.5 kV,锥孔电压为30 V,离子源温度为150 ℃,脱溶剂气温度为450 ℃,脱溶剂气流速为800 L/Hr,锥孔气流速为50 L/Hr,碰撞能量为3 V。恩诺沙星和环丙沙星的定性及定量离子对质谱参数见表2,恩诺沙星标准物质和环丙沙星标准物质的总离子流色谱图(Total Ions Chromatograph,TIC)和定量离子图见图1。
表2 恩诺沙星和环丙沙星的质谱分析条件参数及保留时间
图1 恩诺沙星和环丙沙星标准物质的定量离子图
考虑实验过程中恩诺沙星的浓度随时间降解,以上机浓度为1、5、10、20和50 ng/mL的梯度绘制标准曲线,曲线线性良好,回归系数均大于0.999 6,实验前对空白水样进行恩诺沙星加标处理,样品回收率在81%~112%,以样品上机3倍和10倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ),检测限和定量限值均小于0.2 ng/mL。
1.7 生物富集
生物富集系数(Bioconcentration factors,BCF)是用来描述化学物质在生物体累积趋势的重要指标。实验结束时,某种抗生素在生物体内以及在水中的含量变化基本保持平衡,此时生物体对抗生素的富集系数为:
BCF=Cfs/Cws
式(1)
式中,Cfs表示平衡时,生物体内的药物含量(mg/kg);Cws表示平衡时生物体所在的水环境中药物的含量(mg/kg)。
1.8 数据处理
数据统计及相关绘图在Excel 2010软件中完成,以P<0.05作为差异性显著水平。结果用平均值±标准偏差来表示,在进行多重比较时,用*表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 恩诺沙星在中华绒螯蟹可食部位中的富集系数
从表3可知,当中华绒螯蟹暴露在低浓度的恩诺沙星水环境时,不同可食部位的富集系数从大到小依次是蟹腿肉>蟹身肉>性腺>肝胰腺,说明在低浓度时,蟹腿肉和蟹身肉的富集能力最强;当暴露在中浓度的水环境时,恩诺沙星的富集系数从大到小依次是蟹身肉>肝胰腺>蟹腿肉>性腺,说明中浓度条件下,中华绒螯蟹蟹身肉的富集能力最强;当暴露在高浓度的水环境时,恩诺沙星在中华绒螯蟹各部位的富集系数从大到小依次是蟹身肉>性腺>肝胰腺>蟹腿肉,其中蟹身肉和性腺的富集系数相近,说明高浓度组中,蟹身肉和性腺的富集能力较强。由3个浓度组的结果综合可知,恩诺沙星在蟹身肉中的富集能力最强。
表3 不同浓度的恩诺沙星暴露下中华绒螯蟹可食部位的富集系数
2.2 不同浓度的恩诺沙星暴露下中华绒螯蟹各可食部位药物残留随时间的变化
由图2A的结果可知,试验开始1周时,中华绒螯蟹蟹腿肉中恩诺沙星的残留量在低、中、高三个浓度组含量分别是(12.75±1.96)、(79.88±22.88)和(488.52 ±160.72)ng/g。随着时间的推移,三个浓度组恩诺沙星蓄积量逐渐增加,在2周时达到最高值,含量分别为(28.38±2.94)、(101.21±28.05)和(746.93±174.39)ng/g,之后残留浓度逐渐降低。在整个养殖期间,高浓度组蟹腿肉中恩诺沙星的残留量相较于低、中浓度组均存在显著性差异(P<0.05)。
从图2B的结果可知,在整个养殖期间,低浓度组在1周时中华绒螯蟹身肉中恩诺沙星的蓄积量为(18.76±1.54)ng/g,在2周时达到最大值,浓度为(33.02±2.21)ng/g,之后恩诺沙星的含量随着时间的推移缓慢下降;中浓度组在1周时蟹身肉中药物的残留量为(72.81±12.28) ng/g,在3周时达到最大值,浓度为(185.04±16.58) ng/g,之后蓄积的含量随时间的变化缓慢降低并维持在一个稳定的范围内;高浓度组蟹身肉的蓄积量在1周时为(671.47±79.94) ng/g,在2周时达到最大,为(1 013.90±45.74) ng/g,然后维持在一个稳定的范围内。从整个养殖周期来看,低、中浓度组除了在2周时有显著性差异外(P<0.05),其他时间段低浓度组和中浓度组无显著性差异(P>0.05);高浓度组在整个养殖期间均显著高于低、中浓度组(P<0.05)。
图2C的结果可知,低、中浓度组在1周时,中华绒螯蟹性腺中恩诺沙星的残留量分别为(10.53±1.92)和(55.07±2.32) ng/g,在4周时含量同时达到最高,分别为(22.22±4.50)和(143.48±21.30) ng/g;高浓度组在1周时,性腺中恩诺沙星的残留量为(399.15±28.05) ng/g,在2周时达到最大值,为(1 008.00±116.62) ng/g,之后恩诺沙星的残留量逐渐降低。在整个养殖周期内,除4周时低浓度组和中浓度组之间有显著性的差异(P<0.05),其他养殖时间低浓度组和中浓度组中恩诺沙星的残留量均无显著性差异(P>0.05);高浓度组与低中浓度组之间均存在显著性差异(P<0.05)。
由图2D的结果可知,低浓度处理组在1周时,中华绒螯蟹肝胰腺中恩诺沙星的残余量达到最高,为(24.15±10.03) ng/g,之后含量逐渐降低;中浓度处理组在1周时肝胰腺中药物的残留量为(65.63±14.24) ng/g,在3周时达到最大值,为(312.12±48.59) ng/g,之后逐渐降低;高浓度处理组在1周时药物蓄积达到最大值,含量为(1 035.70±106.35) ng/g,之后肝胰腺中恩诺沙星的残留量降低至稳定的水平,药物含量大约在578.81~667.28 ng/g范围内。高浓度处理组在整个养殖期间均显著高于低、中浓度处理组(P<0.05);而低浓度组和中浓度组在2周和3周时有显著性差异(P<0.05),其他时间均无显著性变化(P>0.05)。
图2 不同浓度的恩诺沙星暴露下中华绒螯蟹蟹腿肉(A)、蟹身肉(B)、性腺(C)和肝胰腺(D)恩诺沙星含量随时间的变化
整个养殖期间,在不同浓度恩诺沙星的水环境中,中华绒螯蟹4个可食部位均检测到恩诺沙星的主要代谢产物环丙沙星的生成。其中中华绒螯蟹性腺和肝胰腺这两个部位生成的环丙沙星量较高,蟹腿肉和蟹身肉在不同浓度组下生成环丙沙星的量相当。由于肝胰腺中环丙沙星的生成量略高于性腺,因此图3选择肝胰腺来分析环丙沙星的生成情况。分析可知,低浓度组在整个养殖期间,中华绒螯蟹肝胰腺中环丙沙星的生成量都很低,含量在0~0.51 ng/g之间;而中、高浓度组随着时间的推移,肝胰腺中环丙沙星的生成量逐渐增加,在5周时达到最大值,分别为(209.6±78.62)和(3 207.11±952.84)ng/g。而高浓度组显著高于低、中浓度组(P<0.05),低浓度组与中浓度组之间在整个养殖期间都无显著性差异(P>0.05)。
图3 中华绒螯蟹肝胰腺中环丙沙星的生成情况
从整体来说,中华绒螯蟹暴露在含有不同浓度的恩诺沙星水环境中,其可食部位中恩诺沙星的蓄积量随着时间的推移先升高后降低,与恩诺沙星的暴露浓度呈正相关关系。另外,在不同浓度的恩诺沙星暴露下,蟹腿肉和蟹身肉的富集系数从大到小依次是低浓度处理组>中浓度处理组>高浓度处理组,性腺的富集系数从小到大为低浓度处理组>高浓度处理组>中浓度处理组,肝胰腺的富集系数从大到小为中浓度处理组>高浓度处理组>低浓度处理组。总的来说,当中华绒螯蟹暴露在不同浓度的恩诺沙星的水环境时,抗生素浓度越低,其在中华绒螯蟹体内的富集能力越强。
2.3 中华绒螯蟹体内恩诺沙星含量的性别差异
根据图4的结果可知,处理组中母蟹和公蟹体内恩诺沙星的蓄积量随着暴露时间的增加,呈现出先升高后逐渐降低的趋势;母蟹和公蟹在相同浓度恩诺沙星的暴露下,体内可食部位(蟹腿肉、蟹身肉、性腺和肝胰腺)总的蓄积量随时间的变化都呈现先升高后降低的趋势,其中低浓度组和中浓度组中公蟹的残留量在整个养殖期间基本都大于母蟹,而高浓度组中,1周和2周时,公蟹的残留量大于母蟹,后3周母蟹大于公蟹。因此整体上来看,公蟹和母蟹的恩诺沙星残留存在一定的性别差异,但是差异不显著(P>0.05),说明恩诺沙星的暴露浓度和暴露时间可能会影响公母蟹体内恩诺沙星的蓄积量,但是具体的差异以及差异机制需要进一步研究。
图4 中华绒螯蟹体内恩诺沙星含量的性别差异
由图5的结果可知,低浓度组中,公蟹和母蟹体内环丙沙星的生成量随着养殖时间的增加无明显变化,且公蟹和母蟹体内可食部位环丙沙星总的生成量在整个养殖期间相差不多;中浓度组和高浓度组中,公蟹和母蟹体内可食部位环丙沙星总生成量随着养殖时间的延长而增加,其中公蟹体内环丙沙星的生成量大于母蟹,这种差异在第1周表现最为明显。因此,公蟹和母蟹体内环丙沙星的生成量在低浓度恩诺沙星暴露下无明显差别,但在中、高浓度暴露下存在一定的性别差异。
图5 中华绒螯蟹体内环丙沙星生成的性别差异影响
3 讨论
3.1 恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的富集效应
中华绒螯蟹暴露在不同浓度恩诺沙星的水环境时,其体内不同可食部位(蟹腿肉、蟹身肉、性腺和肝胰腺)中恩诺沙星的蓄积量随着养殖时间的推移,先升高后逐渐降低,并且各组恩诺沙星的残留量与暴露浓度正相关,呈现一定的剂量-效应关系。在整个养殖周期中,低浓度组中华绒螯蟹各可食部位中恩诺沙星的残留量为蟹身肉>蟹腿肉>性腺>肝胰腺;而中浓度组和高浓度组各可食部位中药物的残留量大致为蟹身肉>肝胰腺>性腺>蟹腿肉。此外,对照组中恩诺沙星的残留顺序大致为蟹身肉>蟹腿肉>性腺>肝胰腺,结果与低浓度组相同。吴光红等[17]研究了恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的药物代谢动力学,结果显示中华绒螯蟹在肌肉注射恩诺沙星后,0~2 h之内,4个组织中的药物浓度关系是鳃>血液>肌肉>肝胰腺[17]。由此可见,在养殖生产过程中,中华绒螯蟹体内恩诺沙星主要富集的可食部位是蟹身肉,肝胰腺仅次于蟹身肉。
本次实验在低、中、高三个浓度暴露下,恩诺沙星在中华绒螯蟹体内不同可食部位的蓄积量与暴露浓度正相关。根据结果可知,高浓度处理组与低、中浓度处理组之间差异较大,但不呈倍数关系。说明暴露浓度越大,恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的蓄积量就越大。当中华绒螯蟹对恩诺沙星的蓄积达到平衡时,随着养殖时间的增加,其体内的恩诺沙星的残留值不再增加,会稳定在一个浓度范围内。低浓度组中的中华绒螯蟹由于暴露浓度较小,母蟹和公蟹的存活率相对较高;中、高浓度组由于暴露浓度较大,养殖期间存在螃蟹死亡的现象,公蟹之间打斗蚕食的现象也比较严重,很多公蟹的蟹腿不完整。并且中、高浓度组在养殖后期,体内的部分器官发生病变,性腺和肝胰腺都发生不同程度的萎缩,其代谢能力下降。低浓度组各个可食部位恩诺沙星的残留量在整个养殖期间都小于恩诺沙星残留的限定标准。因此,在中华绒螯蟹养殖过程中使用恩诺沙星时,应综合考虑养殖环境和养殖密度,尽量减小养殖水体中药物的浓度,控制在50 ng/mL左右,这样可以尽量减少恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的残留,从而保障水产品的质量安全。
关于不同性别中华绒螯蟹对恩诺沙星蓄积的影响,根据结果可知,恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的蓄积情况与其性别关系不密切,公蟹和母蟹之间的差异不显著(P>0.05)。在研究恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的代谢情况时发现,当公蟹和母蟹大剂量肌肉注射药物时,公蟹和母蟹体内的恩诺沙星半衰期存在明显的差异,母蟹吸收和消除显著快于公蟹[18]。说明,环境中恩诺沙星的超过一定的暴露剂量,其药物在中华绒螯蟹体内的蓄积情况存在性别差异。
3.2 恩诺沙星的主要代谢产物环丙沙星的生成情况
有研究表明,恩诺沙星在鱼[19]、虾[20]等的体内均可以脱去一个乙基而生成环丙沙星,且存在种间差异。潘明轩等[20]研究中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)通过肌肉注射恩诺沙星,观察其在体内的代谢情况,在检测过程中发现环丙沙星的存在[21]。Intorre等[22]研究鲈(Lateolabraxjaponicas)体内恩诺沙星的代谢情况时,在鲈的血液和肝脏中也检测到了环丙沙星的存在。
在本次暴露实验的研究过程中,发现在中华绒螯蟹体内也检测到环丙沙星的生成。低浓度组中,环丙沙星的生成量较少,与空白组相当,说明在低浓度状态下,恩诺沙星仅有很少的一部分脱去乙基代谢成环丙沙星,相较于其他高等生物、代谢率较低。中华绒螯蟹属低等生物,因此新陈代谢可能比较缓慢,也可能与体内缺乏某种乙基肝微粒体酶有关[17]。在中、高浓度组,由于使用的恩诺沙星的浓度要大于正常使用量,所以恩诺沙星在中华绒螯蟹体内可能呈现被动吸收的状态。过量的恩诺沙星对于中华绒螯蟹来说是一种外来刺激物,因此机体为了保护自身,会通过鳃、触角腺等排泄器官将多余的恩诺沙星排出体内或者转移到肝胰腺等器官将其降解,来降低药物对机体的刺激[12]。这也解释了肝胰腺部位检测出的环丙沙星含量较高的原因,说明肝胰腺是恩诺沙星代谢的主要部位[23]。
关于螃蟹的性别差异对环丙沙星生成的影响,由结果可知,低浓度暴露条件下,公蟹和母蟹生成环丙沙星的量差异不大;中、高浓度条件下,公蟹体内环丙沙星的生成量高于母蟹,但差异不显著(P>0.05)。说明在恩诺沙星暴露浓度较高的情况下,存在一定的性别差异,但具体的差异以及差异机制需要进一步的探究[21]。
4 结论
恩诺沙星在中华绒螯蟹体内不同可食部位残留的情况与暴露浓度的剂量存在一定的剂量-效应关系,且恩诺沙星主要蓄积在蟹身肉部位,肝胰腺仅次于蟹身肉。根据富集系数的结果可知,富集能力较强的是蟹身肉。此外,性别差异对恩诺沙星在中华绒螯蟹体内的蓄积存在一定的影响,但差异不显著。同时,实验组中华绒螯蟹可食部位均检测到环丙沙星的存在,且环丙沙星的生成量同样与恩诺沙星的暴露浓度正相关,其中肝胰腺是环丙沙星的主要生成部位。中华绒螯蟹的性别差异对环丙沙星的生成存在一定的影响,具体的情况有待进一步探究。