同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱测定肉类中17 种全氟化合物

2022-03-23林永涛谢燕湘曾小元李兆敏黄开慧

食品安全导刊 2022年33期

林永涛，谢燕湘，曾小元，李兆敏，黄开慧

（常德市疾病预防控制中心，湖南常德 415000）

全氟化合物（Perfluorinated Compounds，PFCs）是一大类有机化合物中与碳原子相连的氢原子被氟原子完全替代的有机物的统称，主要包括全氟烷基类、全氟羧酸、全氟磺酸、全氟磷酸等，因其结构中含有高键能的碳氟键，而化学性质稳定，能够受强的紫外光照、加热、化学和微生物作用，在自然环境中能长期存在难以降解[1-2]。PFCs 广泛应用于阻燃剂、表面活性剂、催化剂、杀虫剂和纺织品等诸多领域[3-4]。PFCs 具有神经毒性、免疫毒性、遗传毒性、甲状腺毒性等，研究表明，PFCs 通过各种途径进入自然环境中，并能通过食物链累积[5-8]。肉类是人类必不可少的食物来源，食品中主要肉类来源的相关动物在食物链中处于中后端，使处于食物链顶端的人类食用相关肉类后存在的健康风险加大。目前肉类中PFCs 测定相关国标是《食品安全国家标准动物源性食品中全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）的测定》（GB 5009.253—2016），只测定其中两种PFCs，没有多种PFCs 的检测方法，不能全面反映肉类中PFCs 污染情况，建立相关分析方法了解肉类食品中PFCs 的含量对食品安全标准的制定有一定参考意义[9-12]。同位素内标法是在样品前处理过程中加入待测化合物的同位素内标物，利用待测物与对应的同位素内标物响应的比值来测定待测浓度的方法，弥补了外标法的一些不足，增强了分析结果的准确性和可靠性[13-16]。本实验用同位素内标法，采用乙腈/水超声萃取肉类中17 种PFCs，经固相萃取柱净化分离，由UPLC-MS/MS 分析检测，定量准确、灵敏度高，用于实际肉类样品中PFCs的分析测定，获得了满意的结果，为肉类质量安全检测及相关标准制定提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪，配Turbo V 电喷雾离子源（QTRAP 4500，美国AB SCIEX 公司）；Analyst 1.7.2 数据处理系统（美国AB SCIEX 公司）；ExionLC 超高效液相（日本岛津公司）；色谱柱：Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，飞诺美公司）；Milli-Q Ultrapuer Water 超纯水自动制水系统（美国密理博公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-250DE 型数控超声萃取器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；NP-30S 涡旋样品混匀器（常州市恩培仪器制造公司）；QSJ-C04B1 小熊样品粉碎机（佛山小熊电器股份有限公司）；1.0 mL 和 5.0 mL Eppendorf 手动移液枪（德国Eppendorf 股份公司）；湘仪TGL-20M 台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；针式过滤器：0.22 μm孔径尼龙滤膜（津腾公司）；气源：氮气发生器（Peak公司）；固相萃取柱：Captiva EMR-Lipid，3 mL，300 mg（Agilent 公司）。

17 种全氟化合物混合标准品：购自天津阿尔塔科技有限公司，浓度为100 μg·mL-1，溶剂为乙腈；9 种全氟化合物的18O 取代或13C 取代同位素混合内标溶液：美国Wellingtons Lab 产品，9 种同位素混合内标溶液的浓度是2 000 ng·mL-1，混合标准溶液溶剂是甲醇。实验用17 种全氟化合物混合标准溶液里面包含13 种全氟取代烷基羧酸和4 种全氟取代烷基磺酸盐，它们分别是全氟丁烷羧酸（PFBA）、全氟戊烷羧酸（PFPeA）、全氟己烷羧酸（PFHxA）、全氟庚烷羧酸（PFHpA）、全氟辛烷羧酸（PFOA）、全氟壬烷羧酸（PFNA）、全氟癸烷羧酸（PFDA）、全氟十一烷羧酸（PFUdA）、全氟十二烷羧酸（PFDoA）、全氟十三烷羧酸（PFTrDA）、全氟十四烷羧酸（PFTeDA）、全氟十六烷羧酸（PFHxDA）、全氟十八烷羧酸（PFODA）、全氟丁烷磺酸钾（PFBS）、全氟己烷磺酸钠（PFHxS）、全氟辛烷磺酸钾（PFOS）和全氟癸烷磺酸钠（PFDS）。9 种全氟化合物内标溶液中含有7 种全氟烷基羧酸13C 取代内标和2 种全氟烷基磺酸盐18O 取代内标，它们分别是全氟丁烷羧酸内标（13C4-PFBA）、全氟己烷羧酸内标（13C2-PFHxA）、全氟辛烷羧酸内标（13C4-PFOA）、全氟壬烷羧酸内标（13C5-PFNA）、全氟癸烷羧酸内标（13C2-PFDA）、全氟十一烷羧酸内标（13C2-PFUdA）、全氟十二烷羧酸内标（13C4-PFDoA）、全氟己烷磺酸钠内标（18O2-PFHxS）和全氟辛烷磺酸钾（13C4-PFOS）。

甲醇（质谱级，德国Merk 公司）；甲酸（质谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸铵（质谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（质谱级，德国Merk 公司）。

1.2 仪器条件

（1）色谱条件。流动相A：浓度为2 mmol·L-1甲酸铵水溶液；流动相B：纯甲醇；流速： 0.30 mL·min-1；色谱柱温：40 ℃；样品进样体积：10 μL；梯度洗脱程序：0 ～2 min 时，流动相A、B分别为60%和40%，2 ～7 min 时流动相A、B 分别为5%和95%，7 ～10 min 流动相A、B 分别为60%和40%。

（2）质谱条件。Turbo V 电喷雾离子源（ESI）；串联质谱检测模式：多反应离子监测（MRM）；质谱离子化电压：-4 500 V；离子源温度：555 ℃；气帘气的气体压力：37 psi；碰撞气流速：中等；雾化气气体压力：51 psi；辅助气气体压力：51 psi；驻留时间：16 ms。

1.3 标准溶液配制

用甲醇将17 种混合标准溶液和9 种同位素混合内标溶液分别配制成浓度为200 ng·mL-1使用液， 4 ℃保存。用甲醇/水溶液（40/60）将17 种混合标准溶液逐级稀释为浓度0.2 ng·mL-1、0.4 ng·mL-1、 0.8 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、1.5 ng·mL-1和2.0 ng·mL-1混合标准点组成的标准系列溶液，每个标准点中全氟化合物的定量内标物浓度均为1.0 ng·mL-1。

1.4 样品采集与处理

肉类样品采自市区各大菜市场和超市。准确称取样品2 g（精确至0.00 01 g）置于15 mL 聚丙烯具塞离心管中，加入100 μL 全氟化合物同位素内标稀释使用液（200 ng·mL-1），准确加入2.0 mL 超纯水，涡旋振荡3 min，加入色谱纯8.0 mL 乙腈，超声萃取30 min，10 000 r·min-1常温离心10 min，取上清液3.0 mL 过固相萃取柱，弃去约1 mL 流出液，过0.22 µm 有机滤膜，取过滤液0.5 mL加超纯水0.5 mL 混匀，供UPLC-MS/MS 测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

不同的流动相组成对样品的分离起重要作用，考察了以0.1%甲酸水/甲醇、0.1%甲酸水/乙腈、2 mmol·L-1甲酸铵水/ 甲醇和2 mmol·L-1甲酸铵水/乙腈为流动相时，17 种全氟化合物在等度洗脱和梯度洗脱条件下的响应及分离效果。结果表明，以2 mmol·L-1甲酸铵水/甲醇为流动相进行梯度洗脱时17 种全氟化合物可以较好地分离。色谱柱同样影响样品的分离，比较了Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）和ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）两种类型的色谱柱对17种全氟化合物的分离情况，结果显示两种色谱柱都能实现较好的分离，Kinetex C18柱分离效果更佳，峰形更对称，且能够在10 min 内分离17 种全氟化合物，ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 柱需要15 min 以上，为提高分析效率，采用Kinetex C18柱进行分析。

2.2 质谱条件优化

配制浓度为100 μg·L-1的17 种全氟化合物和9种内标物的使用液，选择ESI（-）电离模式，用针泵进样，在质谱模式下，对各化合物进行全扫描，获得每种氟化物的母离子信息，再经质谱子离子扫描，得到每种氟化物的子离子信息，根据每种离子丰度比选择相应的定量、定性离子对，并对每种氟化物的去簇电压和碰撞能量参数进行优化，从而得到最优MRM 模式下质谱的检测条件。17 种全氟化合物和9 种内标物的MRM 质谱采集参数见表1。在优化好的条件下进行测定，1.0 ng·mL-117 种全氟化合物和9 种内标物的总离子流图如图1 所示。

表1 17 种全氟化合物和9 种内标物的MRM 模式质谱优化参数

图1 17 种全氟化合物和9 种内标物的总离子流图（1.0 ng·mL-1）

2.3 线性范围、检出限、定量限、精密度和回收率

按照优化的仪器条件，由低浓度的标准溶液到高浓度的标准溶液依次进行测定。以待测物和与之对应内标物的浓度比值作为横坐标，以待测物的峰面积和与之对应内标物峰面积的比值作为纵坐标，绘制标准曲线，17 种全氟化合物在0.2 ～2.0 ng·mL-1线性关系良好，相关系数r均≥0.993。采用空白基质进行加标实验以3 倍信噪比（S/N=3）估算待测物的检出限，以10 倍信噪比（S/N=10）估算待测物的定量限，以2 g 样品经处理后定容至1 mL 计，17 种全氟化合物的标准曲线、相关系数、定量限及检出限见表2。分别准确称取2 g（精确至0.000 1 g）未检出全氟化合物的肉类样品猪肉和鱼肉各一份添加 100 μL 浓度为200 ng·mL-1的17 种全氟化合物标准溶液，与实际样品一样前处理后进样，连续进样6 次，其回收率及其相对偏差（RSD）见表2。