食品中抗生素抗性基因及检测技术研究进展

胡燕玲，陈亚波，金倩仪

（中山市食品药品检验所，广东中山 528400）

抗生素（Antibiotics）是20 世纪医学研究上的重要发现之一，主要应用于治疗和预防疾病、促进机体生长发育等[1]。抗生素属于抑菌剂，对机体内微生物的生长和代谢活动具有较大的抑制能力，在含量较低的浓度下就可以在某种程度上抑制甚至消灭其他微生物[2]。自抗生素问世后，广泛被应用于治疗人与动植物的疾病，曾被认为是可以治愈任何细菌感染的灵丹妙药。我国养殖业中抗生素的滥用十分严重。调查显示，2007 年我国抗生素年生产量达到210 000 t，其中46.1%用于畜牧养殖业；2013 年我国生产248 000 t 抗生素，国内使用约162 000 t，其中84 240 t 用于畜禽养殖业，主要用于养猪业与养鸡业，磺胺类、大环内酯类、氟喹诺酮类、四环素类、β-内酰胺类及其他抗生素所占比例分别为5%、26%、17%、7%、21%和24%[3-5]。抗生素产生的耐药性已经是全世界共同面对的问题，从世界卫生组织的数据记载获知，目前每年全世界感染耐药性病原微生物的人数达200 万，有高达14 000 人以上因耐药菌具有抗生素抗性基因而医治无效死亡[6]。现阶段，我国仅有大型医院会严格控制抗生素的滥用情况，但在食品原料方面，如水产品养殖、畜禽养殖及蔬果种植业中非法使用和添加抗生素的现象仍未得到改善。养殖业中各种添加滥用抗生素的情形尤为突出，促使微生物中抗性基因向更加复杂多样化的耐药模式转变、扩散且持续长久的存在。抗生素抗性基因在人们日常生活环境中持续长时间的存在以及在不同寄主的传播水平通常比抗生素本身带来的危害更加严重，因此食品中抗生素抗性基因检测研究已成为食品科学领域新的研究热点[7]。

1 国内外抗生素抗性基因研究现状

现有国内外资料记载对抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）的研究重点集中于大自然气体等环境介质、水质和土壤。LU 等[8]对辽河一带水质进行研究，发现所有水体中都能检测到3 种磺胺类耐药基因，是因为养殖户在养殖过程中长期使用抗生素，也可能是ARGs 的转移导致的富集。KERRY 等[9]研究发现养殖池塘中携带ARGs的耐药性菌株种类和数量多于未使用过抗生素的河流。MUZIASARI 等[10]研究的波罗的海渔场海水中抗生素抗性基因污染情况显示，渔场检测到丰富的ARGs，尽管渔场中没有使用氨基糖苷类抗生素，但在农场沉积物中富含氨基糖苷类抗生素的抗性基因，说明水体中ARGs 污染较严重。目前在食品领域中对于ARGs 的研究在样品类型和检测手段方面都在不断拓展，研究成果丰硕。

1.1 国内研究发展现状

近年来食品领域中ARGs 的研究逐渐成为热点。叶蕾[11]最早以广州市水产养殖品作为研究对象，通过聚合酶链式反应和16S rRNA 测序方法研究水产养殖品中耐药共生菌的耐药水平，分析耐药决定因子和耐药菌菌体类型，发现505 株多重耐药细菌中，耐磺胺药物的sulI 基因以及多重耐药细菌含有Ⅰ型整合子整合酶基因intI 的约有1/4。其中含耐磺胺药物sulII 基因的多重耐药菌占15%，含抗四环素tetE基因的多重耐药菌占5%。在多重耐药细菌中的分布比中抗红霉素耐药基因ermB、ermC 以及β 内酰胺酶编码抗性基因blaTEM、blaCMY 的占比分别为1.3%和0.3%及4.5%和1.7%。刘宗保[12]利用荧光定量PCR 对厦门市某养殖场的部分猪肉样品中的耐药基因进行定量分析，使用变性梯度凝胶电泳（Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）研究生猪养殖场环境及猪肉样品的细菌群落结构，使用宏基因组高通量测序的方法分析养殖场土壤中的耐药基因分布情况。结果表明，猪肉样品中ARGs 污染严重，养殖场土壤中存在大量的耐药基因，并发现新的耐药基因。冯淑贞等[13]应用实时荧光定量PCR 技术对采集自内蒙古锡林郭勒牧区的11 份传统发酵乳制品中常见抗生素抗性基因丰度进行了绝对定量检测，结果发现22 种常见抗性基因均有检出。王慧平[14]对ARGs 研究是在总DNA 水平上采用实时荧光定量PCR 技术系统分析ARGs 的污染状况，样品来源为市售水产品、蔬果产品、肉制品和某养殖场猪粪便样品，结果表明各个样品中均存在一定程度的ARGs污染。超市的污染最低，其次是水产品市场，来自菜市场的水产品及蔬菜样品抗生素抗性基因污染最为严重。食品是ARGs 进入人体的直接载体，因此对各类食品中的抗生素抗性基因进行定量和分布状况研究有着深远的意义。虾类、鱼类产品是常见的食材，但水产养殖业普遍滥用抗生素，对人体健康造成了威胁[15]。李娟等[16]选取养殖场周边农田10 份蔬菜样品，通过PCR 方法，分析研究了喹诺酮类、氯霉素类、大环内酯类、四环素类和磺胺类等5 类ARGs分布情况。四环素类ARGs 和磺胺类ARGs 残留最高，且范围最广，蔬菜表面、内部检出率分别为70%和100%。其次是喹诺酮类ARGs，蔬菜表面、内部检出率分别为100%和60%。结果表明，畜禽养殖场周边的蔬菜ARGs 污染较为严重，可能会导致蔬菜内部细菌产生耐药性，进而通过食物链传播进入人体。但总体来说，对食品中ARGs 的研究尚缺乏系统性，样品类型覆盖面不够，且研究的技术手段仍局限于PCR 或荧光定量PCR，至今鲜见有采用宏基因组方法研究食品中ARGs 的文献报道。因此，人们对食品中存在哪些ARGs 尚缺乏深刻的认识。

1.2 国外研究发展现状

宏基因组学是一种新的基因组学技术，通过提取样品中全部微生物总DNA，构建基因组文库，研究全部微生物的基因组，并探究微生物群落结构和功能。宏基因组学具有巨大的应用前景，可用于分析微生物群体的多样性与丰度、环境中微生物群体基因组成及功能，可用于研究微生物与环境、宿主间的关系，也能在发现具有特定功能的基因以及衡量微生物群落宏基因组表达水平等方面广泛应用[17-18]。但宏基因组学方法主要应用于环境领域[19-20]。近年来，随着人们食品安全意识的提高，越来越认识到食品中抗生素抗性基因残留在人类健康和环境污染等方面的严重性。随着宏基因组学技术的发展，在自然环境、动植物和人体内检测到越来越多的ARGs，利用宏基因组学技术可以研究存在于不同领域的ARGs，建立完整的宏基因组文库，也可以研究ARGs 的抗生素耐药机制与传播途径之间的联系。相比于普通PCR、荧光定量PCR或高通量PCR，利用宏基因组学方法可在更大程度上帮助人们更全面地了解ARGs 在不同环境中的丰度与多样性变化，对构建或完善现有的宏基因组文库、研究ARGs 对人们的潜在威胁具有重要意义。但基于高通量测序的宏基因组学方法在食品领域的应用仍较少[21]，特别是在水产品、畜禽产品、发酵食品等食品中ARGs 的研究上尚属空白。

2 食品中抗生素抗性基因检测技术研究进展

ARGs 被认定为21 世纪新型污染物，目前针对ARGs 的大多数研究主要集中在土壤、饮用水和生活污水等环境领域，对于食品领域中ARGs 的研究报道不多[22-25]。在当今人们越来越关注食品安全的大环境下，关于食品中抗性基因的丰度研究也应该受到关注。最近的研究显示，虾、鱼和贝类等水产品中磺胺类、四环素类、氨基糖苷类抗生素抗性基因检出6 类抗生素抗性基因（tetA、tetB、tetM、sul Ⅱ、floR、aphA-1、aadA、ermB、cmlA）和Ⅰ类整合子5’端整合酶基因intI1、3’端磺胺耐药基因sul Ⅰ、季铵盐化合物及溴化乙锭的耐药基因qacEΔ1[26]；发酵乳制品中检出tetO、ermB、cat 等22 种常见抗性基因[27]。以上研究结果显示，由于ARGs 在环境及食物链中的基因水平转移，食品中ARGs 的污染越来越严重，需采用更先进的技术全面分析ARGs 的多样性和丰度。然而目前食品领域ARGs 的检测分析主要基于荧光定量PCR 技术，该技术单管检测基因数量少，无法全面高通量地分析样品中的所有ARGs。采用高通量测序的宏基因组学方法分析食品中ARGs 的研究至今鲜见报道，迫切需要采用高通量技术手段对食品样品中的ARGs 进行分析，并评价其在食品中的多样性和丰度。

基因芯片技术在ARGs 检测中也有一定的应用。基因芯片技术是将数以万计、甚至百万计的DNA 探针固定于固相载体上形成DNA 微阵列，将样品核酸用荧光或同位素等方法标记，通过与芯片探针杂交检测样本内的多种特定DNA 序列，通过计算机分析，即可得到样品中大量基因序列特征和基因表达信息。由于基因芯片进行一次杂交即可获得样品中大量序列信息，且具有灵敏、准确、多参数同步分析、高度并行性和快速全自动分析的特点，研究者常将其用于样品中大量耐药基因的检测，研究对象主要是环境样品，基因芯片技术应用于食品中ARGs 的研究鲜见报道。该技术在实际应用中也存在一些不足之处，主要是由于目前大部分芯片检测采用荧光染料而非基于探针技术，因此存在基因芯片检测ARGs时特异性不强等问题。为了更好地发挥基因芯片高通量、快速的检测优势，迫切需要根据已知的耐药基因序列设计出相应的特异性强的探针，从而有效避免假阳性、假阴性以及特异性等问题。而TaqMan 微流体基因芯片（TaqMan Low-Density Arrays，TLDA）技术的出现，为研究食品中ARGs 提供了新的思路。TaqMan 微流体芯片具备384 个微孔反应腔，每个微孔可按需求预先包埋针对特定检测靶标设计的DNA引物对和对应的TaqMan 探针。采用TaqMan 微流体芯片检测样品时，只需加入待检测样品的核酸及PCR 预混液配制的溶液即可在一次PCR 扩增过程中，完成多个样品、多个靶标的检测。该基因芯片的优点是高通量筛查，多样品、多基因靶点的同时检测；单孔单重扩增，避免相互干扰；操作简便，省时省力，5 min 完成上样，无需复杂的微量液体移动装置；标准化程度高，消除系统误差，利于实验室间结果比较。由于其采用TaqMan 探针，可以极大提高检测的准确性。可以预见，微流体基因芯片TaqMan 将会在ARGs 的检测分析方面发挥积极作用。然而目前未见基于TaqMan 探针的微流体芯片技术应用于食品中ARGs 的研究报道。

3 结语

目前，食品中ARGs 的研究缺乏系统性，且研究手段较为局限，不能全面了解各类食品中ARGs的分布规律。国内外已有一些采用PCR、荧光定量PCR 分析食品中ARGs 的报道，但是对于采用基于高通量测序的宏基因组学和基于TaqMan 探针的基因芯片技术检测食品中ARGs 的研究尚属空白，特别是人们对于各类食品中ARGs 的多样性和丰度以及迁移规律的认识还有待探究。宏基因组学作为近年发展出来的一种新的基因组学技术，通过宏基因组学分析可以全面了解研究对象的基因组成、功能以及微生物群落结构信息。随着高通量测序技术的发展以及测序成本的降低，该方法在研究基因组成及微生物群落多样性方面应用越来越广泛。本研究所涉及的另一技术基因芯片技术，该技术在食品领域应用主要在转基因检测和致病菌检测方面，国内外未见有应用于水产品、畜禽产品、发酵食品等食品中ARGs 的报道。TaqMan 微流体基因芯片（TaqMan Low-Density Arrays，TLDA）技术，对水产品、畜禽产品、蔬菜、发酵食品等样品中的ARGs 类型、相对丰度、多样性，同时筛选出上列不同类型样品中共有及特有的ARGs 保守序列，后续通过TaqMan 微流体芯片等基因芯片方法开发针对性的ARGs 芯片及建立快速ARGs 检测方法。由于使用TaqMan 探针，相比于其他基因芯片技术，检测特异性和灵敏度将更具优势。基于TaqMan 微流体基因芯片技术的ARGs 高通量基因芯片的研发，可为今后食品安全监管、评估市售食品安全性提供重要的技术支撑和保障，无疑在食品中ARGs 研究的深度及广度方面具有较大的学术价值。