离子选择电极阵列测定土壤中硝态氮

苏 睿 苑 锋 吴俊锋 位文涛 VIJAYA Raghavan 胡建东，3*

(1.河南农业大学机电工程学院，河南省农业激光技术国际联合实验室，郑州 450002；2.McGill大学生物资源工程系，加拿大 蒙特利尔 H9X 3V9；3.小麦玉米作物学国家重点实验室，郑州 450002)

硝态氮是土壤中重要的无机氮肥，可直接被作物吸收利用，土壤中硝态氮的含量是作物当季氮肥施用量估算和生育期追肥诊断的主要依据，增施氮肥是农业增产的重要措施之一，其含量的检测是田间养分管理的重要指标[1-3]。由于硝酸根离子的高水溶性、流动性和生物降解性使它极易受环境温度和农田灌溉及降水的影响而发生变化[4-5]。农用肥料和动物粪便中存在大量硝态氮，随着农田灌溉及降水等原因，过剩的硝态氮会经过淋溶和地表径流流入河湖和地下水导致水体富营养化[6-8]。同时，高浓度的营养物质已被确定为结直肠癌和非霍奇金淋巴瘤的潜在原因[9]。因此，土壤硝态氮的实时测定是精准施肥、作物养分管理和污染监控的重要环节[10-11]。

为实现土壤硝态氮原位实时测定，已尝试了电化学法、光谱法，目前实验室普遍使用光谱方法，与光谱方法相比电化学传感器测量方法具有快速、灵敏、测量范围广、成本低等优点[12-14]。ADAMCHUK等人开发了利用离子选择电极(ISE)直接土壤测试系统(DSM)，用于土壤养分分析和空间变异特征监测，与实验室检测相比硝酸根检测结果相关系数(R2)仅在0.41～0.51[15]。KIM等[16]使用NPK三种离子选择电极与一个参比电极组成传感器阵列测定土壤提取物中的硝态氮浓度与常规实验室测定方法相关系数(R2)为0.89。研究人员开发了一种基于离子选择电极测定土壤养分测绘系统，该系统通常安装在重型农用车上，用于绘制穿越农场地形时的土壤状况[17]。TULLY等[18]使用ISE测量的土壤溶液硝态氮浓度与比色法进行了比较相关系数(R2)为0.96。

为了实现基层科学施肥、促进农业可持续发展、保证农民便捷操作，本论文结合电化学与流动分析法设计了一个全自动、低成本、便捷、易操作的实时土壤硝态氮测定系统。优选了全固态硝酸根离子选择电极，且与温度电极和pH电极融合组成电极阵列，并通过微处理控制蠕动泵完成土壤硝态氮待测溶液的连续流动测量及测试结果的传输。采用微处理器对电化学传感器信号采集、处理、存储、传输和控制蠕动泵流动传输样品并与上位机相互传输。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

硝酸根全固态离子选择电极(ISE)、pH电极、温度传感器(EAInstruments Limited公司)，紫外可见分光光度计(南京菲勒仪器有限公司)。

硝酸钠和氯化钾购自国药化学试剂(上海)有限公司，用于配制一系列硝酸盐标准溶液和土壤浸提液。所有试剂均为分析纯(AR)等级，溶液均使用去离子水配制。

1.2 实际样品的处理

采集许昌市(113°47′08″E，34°09′35″N)和潜江市(112°39′07″E，30°18′23″N)麦田土壤。采用五点取样法采集土壤样品，取样位置为0～20 cm表层土。

1.3 电化学土壤硝态氮测试原理

固态离子选择电极具有体积小、响应快等特点，便于在田间实时测定土壤硝态氮。离子选择电极是一种利用膜电位测定溶液中离子活度或浓度的电化学传感器，当将电极浸入待测溶液时，溶液中的游离待测离子将会扩散于电极膜外侧直至内外浓度达到平衡，这样在膜内侧就形成一个电层，称为膜界电位差，它与外部溶液中的待测离子数量成比例。离子浓度(活度)与电极电位之间的关系用Nernst方程表示

(1)

式中，E为电极检测电势，mV；E0为电极标准电势，mV；R为气体常数，取8.314 J/(mol·K)；T为绝对温度，K；F为法拉第常数，取96487 C/mol；z为待测离子所带电荷数；α为待测离子活度。

1.4 土壤硝态氮实时测定系统设计方案

图1 离子选择电极阵列硝态氮快速测定系统组成 (a)放大电路和阻抗匹配电路；(b)电路设计流程图； (c)土壤硝态氮实时测定系统：①组合电极阵列；②过滤器；③搅拌器；④土壤含水率传感器；⑤步进电机； ⑥蠕动泵；⑦样品池；⑧电子秤；⑨液晶触摸屏和控制电路Figure 1 The system components of nitrate nitrogen measurement using ions selective electrode.(a) Amplification circuit and impedance matching circuit；(b) Diagram of the Electric Control Circuit Design；(c) Real-time determination system of soil nitrate nitrogen：①Combination electrode array；②Filter；③Stirrer；④Soil water content sensor； ⑤Stepper motor；⑥Peristaltic pump；⑦Sample cell；⑧Electronic scale；⑨LCD touch screen and control circuit

2 结果与分析

2.1 离子选择电极系统的响应时间

当将电极浸入有硝酸根离子的待测溶液时，溶液中的游离硝酸根离子将会扩散于电极固态PVC膜外侧，直至内外浓度达到平衡。这样在膜内侧就形成一个电层，称为膜界电位差，它与外部溶液中的硝酸根离子浓度的对数成比例。

根据国际纯化学与应用化学联合会(IUPAC)的建议，达到平衡电位值将电势变化达到总变化量的95%所需要的时间定义为响应时间。随着硝酸根离子浓度的提高，实时测定系统对标准样品的响应时间越快，如图2所示，平衡电势可在15 s内完成响应。

图2 土壤硝态氮实时测定系统对标准样品响应时间Figure 2 Response time of soil nitrate nitrogen real-time measurement system to standard sample.

2.2 离子选择电极系统的灵敏度

根据国际纯化学与应用化学联合会(IUPAC)规定，由低至高浓度检测一系列的硝态氮标准溶液，测定不同浓度(15 000、1 000、750、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 mg/kg)下硝态氮的响应电压。测定完成根据数据绘出硝酸根离子浓度对数与离子选择电极(ISE)响应电压的线性关系图。由图3a可知，离子斜率为-51.63 mV/decade处于理论值(54±5) mV/decade合理范围内。线性范围可确定为10-5～10-2.2mol/L，如图3b所示。空白试剂重复11次测得的检出限(LOD=3S/b。其中S为11次测定值的标准偏差，b为接近LOD标准曲线的斜率)为10-5.23mol/L。

2.3 离子选择电极系统的准确度和精密度

在自动测定条件下，筛选21个土壤样品进行检测，采用五点取样法采集土壤样品。首先添加标准样品，计算加标回收率来评价系统的准确性，如表1 所示，加标回收率在90.0%～110%。每个样品测试7次，计算得各验证样本的相对标准差(RSD)为0.78%～4.5%。结果表明，离子选择电极系统具有的准确度和精密度，可以满足土壤硝态氮的现场检测需求。

图3 土壤硝态氮实时测定系统 (a)标准曲线；(b)检测范围Figure 3 Soil nitrate nitrogen real-time measurement system. (a)Standard curve；(b)Detection range

2.4 与紫外可见分光光度法测定结果比对

选择21个土壤样品分别使用离子选择电极系统和紫外分光光度法测定，测定结果如图4a所示，两者R2可达到0.995 2，两个检测系统测定的结果具有较好的线性关系。将测得数据通过GraphPad Prism软件进行Bland-Altman一致性分析，Bland-Altman法作为新的图形分析法，从集中趋势、离散趋势、同步变化程度多角度评价新旧检验方法或检验系统的一致性，弥补了t检验、相关分析和回归分析的不足。分析两种检测系统的相对偏移，两种检测系统的测定结果一致性较好，测定值均在95%一致性区间内，见图4b。综上所述，相较于复杂的光学检测仪器，该仪器成本低，操作便捷，适用于田间土壤硝态氮实时检测。

表1 土壤硝态氮实时测定系统加标回收率 和相对标准偏差

图4 (a)土壤硝态氮实时测定系统与紫外分光光度计 测定结果的相关性；(b)Bland-Altman图Figure 4 (a)Correlation between the results from ISE system and UV-Vis spectrophotometry；(b)Bland-Altman diagram.

3 结论

采用全固态硝酸根离子选择电极，且与温度电极和pH电极融合组成电极阵列，设计了一个土壤硝态氮实时测定系统，通过微处理控制蠕动泵完成土壤硝态氮待测溶液的连续流动测量及测试结果的传输。相对于标准样品，系统响应时间≤15 s，斜率为51.63 mV/decade。线性范围在10-5～10-2.2mol/L内，最低检测限为10-5.23mol/L。相对标准差在0.78%～4.5%，加标回收率均在90.0%～110%。使用土壤硝态氮实时测定系统对许昌市和潜江市土壤样品进行测定，与国家标准测定紫外分光光度法测定的结果相关性R2可达到0.995 2，通过Bland-Altman一致性分析，测值均在95%一致性区间内，两种方法测值差异无统计学意义，具有较好的一致性。该系统在响应时间、灵敏度、准确度和精确度多方面能满足现场检测要求。