不同磷肥处理下苜蓿根颈抗寒性及在低温胁迫下糖类物质变化

陈卫东，张玉霞*，丛百明，夏全超，田永雷，张庆昕，杜晓艳

（1.内蒙古民族大学农学院，内蒙古自治区饲用作物工程中心，内蒙古 通辽 028041；2.内蒙古通辽市畜牧兽医科学研究所，内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古自治区农牧业科学院，呼和浩特 010010）

紫花苜蓿（MedicagosativaL.）是一种豆科（Leguminosae sp.）苜蓿属（Medicago）多年生草本植物，是世界上种植面积最大的牧草之一[1]。苜蓿对氮肥要求不高，但需施用磷、钾等肥料，尤其磷肥对苜蓿具有至关重要的作用[2-3]。研究表明，磷肥有利于提高苜蓿的固氮能力及抗寒能力[4-5]。因此，合理施用磷肥成为苜蓿能否安全越冬的一个重要因素。鲁剑巍等[6]研究表明，合理施用磷肥是高羊茅安全越冬的有效措施之一，这在水稻[7]、大豆[8]、葡萄[9]的抗寒能力研究中也有所体现。沈祥军等[10]研究表明，施磷可以促进低温胁迫下苜蓿根颈中几种抗寒保护物质（可溶性糖、淀粉）含量的积累，且随着磷肥施用量的增加而增强。但目前关于磷肥提高苜蓿越冬器官中哪种糖类物质含量、不同种类磷肥及用量是否存在差异的研究尚未见报道，因此，本研究对紫花苜蓿分别施用重过磷酸钙和磷酸二铵2种磷肥，并进一步设置不同施肥量处理，于越冬前期挖取苜蓿越冬器官，进行冷藏（4℃）和冷冻（—20℃）处理，研究不同处理下苜蓿根颈的活力及糖类物质含量的变化，分析苜蓿的抗寒保护机制，探讨科尔沁沙地紫花苜蓿安全越冬的磷肥类型及施用量，为科尔沁沙地紫花苜蓿抗寒越冬提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古通辽市内蒙古民族大学科技示范园区（N 43°36′，E 122°22′），试验地为典型的温带大陆性季风气候，年均气温6.4℃，≥10℃年活动积温3 184℃，年均日照时数3 000 h，无霜期150 d，年均降水量379.1 mm，蒸发量约为降水量的5倍，年平均风速3～4 m·s-1。试验田土壤为沙土，新开垦沙化草地，土壤0—20 cm碱解氮含量35.37 mg·kg-1，速效钾含量77.51 mg·kg-1，速效磷含量3.70 mg·kg-1，pH 8.3。

1.2 试验设计

供试苜蓿品种为紫花苜蓿‘公农1号’，由吉林省农业科学院提供。于2018年7月17日播种，播种量22.5 kg·hm-2，条播行距15 cm。播种前撒施氯化钾150 kg·hm-2（K2O），苜蓿生长过程中进行适时喷灌水、除草及病虫害防治等田间管理。8月20日采用沟施方式施用不同种类和不同水平的磷肥。试验采用二因素随机区组试验设计，共设置2种磷肥处理，分别为重过磷酸钙（P2O5含量为44%）和磷酸二铵（P2O5含量为46%）；每种磷肥的施用量均分别设置为100、200、300和400 kg·hm-2，同时设置不施磷肥处理为对照，每个处理3次重复。小区种植面积4 m×5 m，四周设保护行。于封冻期前（11月15日）取样，挖取苜蓿越冬器官，每处理取粗细均匀一致的材料50株，平均分成2份。其中，1份置于4℃冰箱（低温冰箱，温度误差±1℃）中储存；另1份置于程序式低温处理箱模拟低温处理（—20℃）。低温处理时，材料采用脱脂棉包裹，加水适量，再用锡纸包裹，注明编号；处理温度为—20℃的低温处理，以0℃为起点，4℃·h-1的速率降温，到达设定温度—20℃后保持6 h，然后按照4℃·h-1的速率升温至4℃后，取出置于4℃下保持12 h后进行糖类物质的测定。

1.3 测定指标及方法

可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮比色法测定；蔗糖和果糖含量采用间苯二酚法测定；根系（根颈）活力采用TTC比色法测定[11]。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010进行数据整理和分析，采用DPS软件进行二因素试验统计分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同磷肥处理下苜蓿根颈活力在低温胁迫下的变化

不同磷肥处理苜蓿越冬材料在低温冷藏（4℃）处理后，根颈活力随着磷肥施用量的增加呈先升高后降低的趋势（表1）；其中，磷肥施用量为300 kg·hm-2（P2O5）时，根颈活力最强，且显著高于其他处理；当磷肥施用量为200、300和400 kg·hm-2时，施用重过磷酸钙处理苜蓿的根颈活力显著高于施用磷酸二铵处理。经过低温冷冻（—20℃）处理，所有处理的根颈活力均有所减弱，但不同磷肥类型及用量间存在差异；两种磷肥中均以300 kg·hm-2（P2O5）施用量处理紫花苜蓿的根颈活力最高，显著高于无肥对照和100、200、400 kg·hm-2施用量处理；当施用量为300、400 kg·hm-2时，重过磷酸钙处理苜蓿的根颈活力显著高于磷酸二铵处理。由此表明，秋季施用磷肥能够显著提高苜蓿的抗寒性，且施用重过磷酸钙的效果优于施用磷酸二铵，施用量以 300 kg·hm-2（P2O5）为宜。

表1 苜蓿根颈在不同处理下的根颈活力Table 1 Root neck vitalities of alfalfa root necks under different treatments

2.2 不同磷肥处理下苜蓿根颈在低温胁迫下可溶性糖含量的变化

如表2所示，低温冷藏（4℃）处理后，随着磷肥施用量的增加，苜蓿根颈中可溶性糖含量呈先升高后降低的趋势。施用量为300 kg·hm-2时可溶性糖含量最高，且显著高于除400 kg·hm-2磷酸二铵处理外的其他处理；当施用量为100、200、300 kg·hm-2时，施用重过磷酸钙苜蓿根颈中可溶性糖含量显著高于施用磷酸二铵处理。低温冷冻（—20℃）处理后，苜蓿根颈中可溶性糖含量升高，但不同磷肥用量间存在差异；施肥处理苜蓿根颈中可溶性糖含量显著高于不施肥对照（除100 kg·hm-2磷酸二铵处理）；当施用量为300 kg·hm-2时，苜蓿根颈中可溶性糖含量显著高于其他处理及不施肥对照（除400 kg·hm-2磷酸二铵处理）。由此说明，秋季施用磷肥有利于提高苜蓿在低温冷冻处理后根颈中的可溶性糖含量，且施用量以300 kg·hm-2（P2O5）时可溶性糖含量最高。

表2 苜蓿根颈在不同处理下的可溶性糖含量Table 2 Soluble sugar contents of alfalfa root necks under different treatments

2.3 不同磷肥处理下苜蓿根颈在低温胁迫下的蔗糖含量的变化

如表3所示，低温冷藏（4℃）后，苜蓿根颈中蔗糖含量随着磷肥施用量的增加呈先增加后降低或一直增加的变化趋势。其中，施用重过磷酸钙300 kg·hm-2（P2O5）时，根颈中蔗糖含量最高，显著高于除400 kg·hm-2处理外的其他处理；施用磷酸二铵400 kg·hm-2时，蔗糖含量最高，显著高于除300 kg·hm-2处理外的其他处理。低温冷冻（—20℃）处理后，苜蓿根颈中蔗糖含量升高，但不同磷肥用量之间存在差异；施肥处理根颈中蔗糖含量均显著高于不施肥对照。由此说明，秋季施用磷肥能够提高苜蓿根颈在低温冷冻处理后的蔗糖含量，施用重过磷酸钙时施用量以300 kg·hm-2（P2O5）处理蔗糖含量最高；施用磷酸二铵时施用量以 400 kg·hm-2（P2O5）处理蔗糖含量最高。

表3 苜蓿根颈在不同处理下的蔗糖含量Table 3 Sucrose contents of alfalfa root necks under different treatments

2.4 不同磷肥处理下苜蓿根颈在低温胁迫下果糖含量的变化

如表4所示，低温冷藏（4℃）处理后，根颈中果糖含量随着磷肥施用量的增加呈先升高后降低的趋势；其中，施用量为300 kg·hm-2时根颈中果糖含量最高，显著高于除400 kg·hm-2处理外的其他处理；且施用量为 300、400 kg·hm-2时，施用重过磷酸钙处理苜蓿根颈中果糖含量均显著高于施用磷酸二铵处理。低温冷冻（—20℃）处理后，根颈中果糖含量升高，除100 kg·hm-2处理外，施肥处理根颈中果糖含量均显著高于不施肥对照，但不同磷肥种类及用量之间存在差异；当施用量为100和300 kg·hm-2时，施用重过磷酸钙处理根颈中果糖含量显著高于磷酸二铵处理；施用量为300 kg·hm-2时，根颈中果糖含量显著高于除400 kg·hm-2处理外的其他施用量处理及不施肥对照。由此说明，秋季施用磷肥有利于提高苜蓿根颈在低温冷冻处理后的果糖含量，且施用重过磷酸钙效果略优于磷酸二铵，施用量以300 kg·hm-2（P2O5）最佳。

表4 苜蓿根颈在不同处理下的果糖含量Table 4 Fructose contents of alfalfa root necks under different treatments

2.5 不同磷肥处理下苜蓿根颈在低温胁迫下淀粉含量的变化

如表5所示，低温冷藏（4℃）处理后，苜蓿根颈中淀粉含量随着磷肥施用量的增加呈先降低后升高的趋势；其中，当施用量为300 kg·hm-2时，根颈中淀粉含量最低，显著低于其他处理；施用量为200、300、400 kg·hm-2时，施用重过磷酸钙处理根颈中淀粉含量显著低于施用磷酸二铵处理。低温冷冻（—20℃）处理后，淀粉含量降低；不施肥对照根颈的淀粉含量高于或显著高于其他处理，但不同磷肥种类及用量之间存在差异；当施用量为200、300、400 kg·hm-2时，重过磷酸钙处理根颈中淀粉含量显著低于磷酸二铵处理；不同施用量间进行比较，300 kg·hm-2处理根颈淀粉含量显著低于除400 kg·hm-2处理外的其他处理及不施肥对照。由此说明，秋季施用磷肥有利于促进苜蓿在低温冷冻处理下淀粉的转化，且施用重过磷酸钙效果优于磷酸二铵，施用量以300 kg·hm-2（P2O5）最佳。

表5 苜蓿根颈在不同处理下的淀粉含量Table 5 Starch contents of alfalfa root necks under different treatments

2.6 根颈活力与糖类物质含量的相关性分析

如表6所示，低温冷藏处理（4℃）后，根颈活力与果糖含量呈极显著正相关，与淀粉呈极显著负相关；重过磷酸钙处理中，根颈活力与可溶性糖、蔗糖含量呈极显著正相关；磷酸二铵处理中，根颈活力与可溶性糖含量呈显著正相关。低温冷冻（—20℃）后，根颈活力与可溶性糖含量呈极显著正相关；重过磷酸钙处理中，根颈活力与蔗糖、果糖含量呈极显著正相关，与淀粉含量呈极显著负相关；磷酸二铵处理中，根颈活力与淀粉含量呈显著负相关。由此表明，在低温处理下，苜蓿根颈中可溶性糖、蔗糖和果糖含量越高、淀粉含量越低，根颈活力越高，苜蓿根颈受伤害程度越轻。

表6 苜蓿根颈活力与糖类物质含量的相关性Table 6 Correlation between root neck activity and carbohydrate content of alfalfa under different treatments

3 讨论

根颈是水分和养分在植物体内运输的重要通道，也是苜蓿枝条再生的主要部位，根颈活力与植物抗寒性显著相关[12]。朱爱民等[13]研究表明，根颈活力越强苜蓿抗寒能力越强。本研究表明，低温冷冻处理后的根颈活力较低温冷藏处理明显降低，不同磷肥种类及用量处理间存在差异；重过磷酸钙处理苜蓿根颈的抗寒性优于磷酸二铵，且两种磷肥均以300 kg·hm-2（P2O5）施用量时根颈活力最强。由继红等[14]研究表明，Ca2+能够提高苜蓿的抗寒性，因此重过磷酸钙处理苜蓿根颈的抗寒性优于磷酸二铵处理的原因可能是重过磷酸钙中Ca2+的作用。

可溶性糖在植物遭遇低温时可通过提高细胞渗透势来降低细胞结冰温度，促进脯氨酸等抗寒保护物质的积累来增加膜稳定性，并直接作为保护剂来保护原生质体、线粒体及膜上敏感偶联因子，从而全面提高植物的抗寒性[15]。本研究表明，低温冷冻处理（—20℃）后紫花苜蓿根颈中可溶性糖、蔗糖和果糖含量均高于低温冷藏处理（4℃），与葡萄[16]、甜瓜[17]、八角金蝉[18]等作物在面临低温可溶性糖含量升高的结果相一致。可溶性糖直接或间接响应低温胁迫，其中蔗糖作为植物光合作用中的主要产物，在植物遇到低温胁迫时起重要作用[19]。Jiang等[9]研究表明，在越冬期葡萄枝条中蔗糖含量较高并持续上升，由此表明蔗糖与葡萄抗寒性密切相关。杨宁宁等[20]研究表明，冬油菜中淀粉含量随着温度的降低有所提升，与本研究结果不同，可能是由于本研究的低温胁迫温度为—20℃，促进了淀粉向可溶性糖转化以提高细胞渗透调节能力，增强抗寒性。本研究表明，低温冷藏处理后，紫花苜蓿根颈中可溶性糖、蔗糖和果糖含量均随着磷肥施用量的增加先升高后降低，由此说明，适量施用磷肥有利于提高苜蓿根颈中可溶性糖、蔗糖、果糖含量，但过量施用则降低，可能是由于过量的磷元素会限制苜蓿对Ca2+的吸收，从而导致可溶性糖等含量下降。且低温冷冻处理苜蓿根颈中蔗糖、果糖及可溶性糖含量较冷藏处理增加，淀粉含量降低，说明低温冷冻胁迫下淀粉转化为可溶性糖，尤其果糖和蔗糖，提高苜蓿抗寒性。