氢氧化钙抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的机制研究

郭正东，卞阳阳，刘晓迁，王 栋，张思远，杨 健，彭 磊

（1. 海南医学院第一附属医院创伤医学中心，海南 海口 570216；2. 海南医学院急救与创伤研究教育部重点实验室，海南 海口 571199；3.海南医学院第一附属医院创伤与灾难救援研究重点实验室，海南 海口 570102）

创伤性骨髓炎是继发于骨及其周边软组织的炎症，在临床上比较常见，也是临床骨科医师面对的比较棘手的难题，常被人们称为“不死的癌症”［1］。近年来，随着我们国家国民经济水平的飞速提高，国家的第一、二产业的机械化水平也大幅度提升，致使意外事故发生率在不断地增加，故创伤患者的人数也不断增加［2］。随着广谱抗菌药、糖皮质激素等药物的不合理使用，甚至滥用，导致临床上耐药菌株感染的患者病例数呈增高趋势，使用抗生素对临床耐药菌株的抗菌疗效显著降低，目前耐药菌株的感染是临床上比较棘手的难题［3］。金黄色葡萄球菌是创伤性骨髓炎的常见菌之一，由于未能及时清创、抗菌药不规范的使用等各种原因，导致了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）的产生［4，5］。目前临床上针对创伤性骨髓炎的主要致病菌耐药性的问题，如MRSA 的治疗，可使用的抗生素选择比较狭窄，所以探索一种对MRSA 起到高效抑菌且无耐药性的药物是十分必要的，对创伤性骨髓炎的治愈也是非常有意义的。

氢氧化钙（calcium hydroxide）是一种白色粉末状无机化合物，在临床牙科领域，氢氧化钙［6，7］已经成为治疗牙髓炎的常见药物，在水中可以缓慢释放出钙离子和具有碱性性质的氢氧根离子，形成碱性的环境，其pH 可高达12，羟基离子可以有效杀灭牙髓腔中的细菌，具有无耐药性、抗菌谱广等特点，能够对病牙根管部位起到很好的抑菌作用［8，9］。目前关于氢氧化钙对MRSA 的抑菌机制研究相对较少，本课题组利用氢氧化钙的强碱性来杀灭MRSA，以期为开发新型安全、高效、无耐药性的抗菌药用于治疗创伤性骨髓炎提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

MRSA、氢氧化钙（温州医科大学药学院提供）；营养肉汤培养基11B01、营养琼脂培养基11A10（北京三药科技开发公司）；麦氏比浊管（温州市康泰生物科技有限公司）。

菌液的制备：将菌液接种在固态琼脂肉汤培养基上培养24 h 后，挑取一个菌落接种于营养肉汤培养基中，在37 ℃恒温摇床培养24 h，使用前根据麦氏比浊法，利用0.9%的生理盐水将菌液稀释成0.5 McFarland（细菌量相当于1.5×108cfu/mL），再取适量稀释后的菌液用无菌的肉汤培养基稀释至106cfu/mL 备用［10］。

1.2 最小抑菌浓度［11］的测定

利用微孔板稀释法确定MRSA 的最小抑菌浓度。取一块96 孔板，1～8 孔每孔加100 μL 氢氧化钙溶液和100 μL 浓度为106cfu/mL 的MRSA 菌液，使得每孔氢氧化钙最终的浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mg/mL。第9 孔加营养肉汤培养基100 μL 和100 μL 浓度为106cfu/mL 的MRSA 菌液，观察是否有利于细菌生长。第10 孔只加200 μL 营养肉汤培养基，作为空白试验对照组。将每个孔充分混合后在恒温培养箱中培养24 h，取出孔板观察各组细菌的上清液浑浊情况，以上清液无浑浊确定为最小抑菌浓度。

1.3 细菌生长曲线的测定［12］

称取氢氧化钙溶于浓度为106cfu/mL MRSA的菌液中，使得混合菌液中的氢氧化钙的终浓度为8×MIC、MIC、1/4×MIC，未加氢氧化钙的作为对照组，在1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h时分别用酶标仪测取各组OD600的数值。

1.4 荧光显微镜分析细胞膜损伤情况

取对数生长期的MRSA 菌液，利用麦氏比浊法调节菌液的浓度至107cfu/mL，加入氢氧化钙调节浓度至4×MIC，未加氢氧化钙作为对照组。在37 ℃的恒温摇床中共培养1 h 后，分别收集菌液，离心后收集细菌菌体，PBS 离心洗涤3 次，再用PBS 溶液重悬。使用Calcein-AM/PI 双染试剂盒进行染色，室温避光孵育15 min，吸取10 μL 样品固定于载玻片上，用荧光显微镜进行拍照观察。

1.5 扫描电镜观察MRSA 的形态［13，14］

分别取两支10 mL EP 管，第一支EP 管将氢氧化钙用营养肉汤培养基配制成最小抑菌浓度MIC的溶液，第二支EP 管用不加氢氧化钙的营养肉汤培养基作为空白对照组，分别与MRSA 在37 ℃恒温培养箱中共培养1 h，用离心机（5 000 r/min）离心5 min，弃上清，沉淀物分别用pH 值为7.2 的PBS 洗2 次，用2.5%的戊二醛4 ℃固定过夜。后用梯度乙醇进行脱水处理，干燥后喷金，用扫描电镜拍摄MRSA 的形态［15］。

1.6 SDS-PAGE 分析菌体蛋白质［16-18］

取生长对数期的MRSA 进行离心，制备OD600＝1.9 的菌液，在菌液中加入氢氧化钙，使其最终浓度分别为0、MIC、4×MIC，在恒温培养箱中共培养1.5 h，离心后收集细菌，用PBS 缓冲液冲洗3 次，并用超声破碎仪将细菌菌体破碎，将破碎液用冷冻离心机4 ℃，高速离心10 min，取上清液与5×的上样缓冲液混合煮沸5 min，随后上样进行SDS-PAGE实验，并用凝胶成像系统拍照并分析。

1.7 统计学处理

使用GraphPad Prism 8.0 数据处理软件对实验数据进行数据统计及差异显著性分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义（文中标注*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.000 1）。

2 结果

2.1 MIC 的测定

96 孔板第6 孔（氢氧化钙浓度为3.125 mg/mL）上清液为澄清样，由此确定此浓度为MRSA 的MIC。

2.2 细菌生长曲线的测定

MRSA 对不同浓度的氢氧化钙溶液的生长变化趋势如图1 所示，未加氢氧化钙的空白对照组在2 h 后，随着时间的推移，细菌的数量也不断的增多；而实验组随着氢氧化钙量的增加，细菌的对数生长期也往后延迟。当菌液中含有8MIC 的氢氧化钙时，细菌的OD 值并未升高，保持平缓的趋势，说明氢氧化钙对MRSA 有着明显的抑制作用（图1）。

图1 氢氧化钙对MRSA 增殖的影响Fig 1 Effect of calcium hydroxide on proliferation of MRSA

2.3 荧光显微镜分析细胞膜的破损情况

对照组中的图大部分显示绿色荧光，红色荧光相对较少，说明MRSA 未发生明显的细胞膜损伤；而与氢氧化钙共培养的细菌组大部分显示红色荧光，几乎看不到绿色荧光，说明MRSA 的菌体细胞膜完全破坏，几乎全部死亡。根据荧光图像的分析，氢氧化钙作用后红色荧光接近100%。该数据表明，氢氧化钙对MRSA 菌体具有较强的破坏作用（图2）。

图2 MRSA 的荧光显微照片Fig 2 Fluorescence micrograph of MRSA

2.4 扫描电镜观察MRSA 的形态

通过SEM 观察氢氧化钙对MRSA 的影响，如图所示，对照组中未经氢氧化钙处理的细菌具有清晰而光滑的表面；实验组用氢氧化钙处理的细菌，细菌表面吸附了氢氧化钙，并出现了皱缩、变形，甚至发生表面溶解，细菌的完整性遭到严重破坏。由此可见，氢氧化钙可以有效地破坏MRSA 的菌体结构（图3）。

图3 MRSA 的扫描电镜照片Fig 3 Scanning electron micrograph of MRSA

2.5 SDS-PAGE 分析菌体蛋白质

蛋白质是生命活动的主要承担者，干扰蛋白质的合成可以达到抑菌的目的。因此，可以通过SDSPAGE 研究氢氧化钙对MRSA 菌体内部蛋白质的影响，结果如图所示，与0×MIC 组相比，MIC 组、4×MIC 组的蛋白条带的颜色变得相对较浅。结合扫描电镜的结果，推测氢氧化钙严重破坏了MRSA的菌体结构，导致细菌内部的蛋白质外漏（图4）。

图4 氢氧化钙对MRSA 蛋白的影响Fig 4 Effect of calcium hydroxide on MRSA protein

3 讨论

创伤性骨髓炎存在骨骼及其软组织的感染，导致其病原菌难以清除，一直是临床骨科医师难以攻克的难题。金黄色葡萄球菌是创伤性骨髓炎的常见菌之一，由于未能及时清创、抗菌药不规范的使用等各种原因，导致了耐药菌株（如MRSA）的产生，使得创伤性骨髓炎的治疗更加困难［19］。氢氧化钙具有广谱抗菌的作用，且来源方便、价格低廉，因此相关深入的研究抗菌剂具有较高的社会价值和经济价值。

细菌主要由细胞壁、细胞膜、细胞质等构成［20］。大多数抗生素的抗菌机理都是破坏菌体的细胞壁和细胞膜、抑制核糖体合成蛋白质。β-内酰胺类抗生素的作用机制是抑制细胞壁黏肽合成酶，从而让细菌不能合成细胞壁粘肽，破坏了细菌的细胞壁完整性，菌体失去细胞壁的保护作用从而裂解死亡［21］。四环素作用机制主要是限制了氨基酸与细菌内核糖核蛋白体的结合，阻止了蛋白质的合成，从而达到抑菌的效果［22］。在临床诊治过程中，抗菌药的长期不合理使用，致使细菌的耐药性也相应地变强［23，24］。而氢氧化钙是治疗牙髓炎的的常见药物，临床效果非常显著［25，26］。根据扫描电镜可以看出，氢氧化钙溶液与MRSA 共培养1 h 后，大部分的菌体出现皱缩、裂解等现象，细胞膜的完整性遭到了严重破坏。细菌的荧光染色结果表明氢氧化钙对MRSA 细胞膜产生破坏作用，从而起到抑制作用，这与扫描电镜的观察结果相符。

综上所述，氢氧化钙可以抑制MRSA 的增殖，其最小的抑菌浓度为3.125 mg/mL。抑菌机制研究结果表明，氢氧化钙可以破坏MRSA 的菌体形态，致使其表面发生皱缩，甚至破裂，从而达到抑菌的效果。然而氢氧化钙对细菌作用是否还有其他机制参与破坏细菌的DNA 等还需进一步验证。此实验可以为后期开发新型安全、高效、无耐药性的抗菌药用于治疗创伤性骨髓炎提供基础。

作者贡献度说明：

郭正东：参与实验，收集整理数据及撰写论文；彭磊：课题设计和论文校审；卞阳阳、刘晓迁、张思远、王栋、杨健：参与实验及管理报账。