芪仙通络方对脑梗死大鼠血管新生及VEGF 表达的影响

赵建涛，黄佳，罗晓玲，张心怡，周胜强，刘芳*

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南省中医药研究院 湖南长沙 410006

卒中长期威胁人类的健康甚至生命，患者的生活也受到严重影响。在急性期缺血性卒中的药物治疗方面，重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）是目前唯一经认证有效的药物。但该药物时间窗限制较为严格，约90%以上的急性期缺血性脑卒中患者因此不能得到及时的救治[1，2]，所以寻找新的治疗靶点以减轻梗死灶的损伤以及日后相应部位神经功能的恢复成为了新的研究热点，其中促进及影响血管新生的途径和手段为目前新的主要研究热点之一。在急性缺血性卒中过程中，缺血区组织氧浓度的降低常导致代偿性血管新生以满足代谢需求。大量研究表明，血管生成与脑卒中患者的生存率呈正相关[3，4]，中医药治疗中风有着临床可见的成效和其独有的优势，国医大师刘祖贻教授自拟方—芪仙通络方经动物实验表明了其对中动脉阻塞（middle cerebral artery occulusion，MCAO）大鼠模型神经功能恢复，促进远隔损害部位丘脑及黑质的轴突再生﹑及促进神经元细胞突触重塑的作用[5-7]。而实验模型神经功能的恢复与轴突﹑突触再生的过程均需血管输送能量，不同组间神经功能恢复不同可能与梗死区域血管新生情况不同有关，故据此推测芪仙通络方能通过促进血管新生进而促进卒中后神经功能恢复，本研究通过建立MCAO模型，基于在体动物水平，从神经功能评分﹑VEGF表达等方面探究芪仙通络方是否具有促进血管新生的功效。

材料与方法

1 实验动物

于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物合格证：SCXK（湘）2009-0004]购买雄性SPF级SD大鼠40只，月龄1-2月，体重（250±20）g，于湖南省中医药研究院实验动物中心[实验室许可证：SYXK（湘）2020-0008）]进行分笼饲养，每笼5只，适应性喂养1周，实验室温度（24±0.5） ℃，相对湿度 50-60 %，噪声＜50dB。

2 药物及制备

芪仙通络方：黄芪30g，淫羊藿15g，丹参30g，枸杞子30g，制首乌15g，葛根30g，水蛭9g，山楂 15g，药物购于湖南省中医药研究院门诊中药房。煎制中药，以中火熬煮，时间依据高中低浓度不同不等，制备完毕后储存于4 ℃冰箱内备用。丁苯酞软胶囊（NBP），药物购于湖南省中医药研究院附属医院西药房，0.1×24粒 批号 1182006118。

3 主要试剂与仪器

VEGF抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司，货号 GB13034；EDU抗体，碧云天生物技术有限公司，货号 ST076-250mg；CD31抗体，武汉博士德生物工程有限公司，货号GB11063-3；FITC标记山羊抗兔IgG，武汉赛维尔生物科技有限公司，货号 GB22303；HRP标记山羊抗兔IgG，武汉赛维尔生物科技有限公司，货号GB23303；MACO线栓，北京西浓科技有限公司，货号2838-A4；EDU染色试剂盒，武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：C10310；石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号 JB-P5），石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号 RM2016），组织摊片机（浙江金华科迪仪器设备有限公司，型号 KD-P），正置光学显微镜（日本尼康，型号 NIKON ECLIPSE C1），显微镜（日本尼康，型号 NIKON E100）。

4 实验方法

4.1 造模与评价 参考课题组前期研究方法，采用改良Longa线栓法[8]复制MCAO大鼠模型。假手术组其他步骤和手术组相同，但结扎左侧颈总动脉后不导入线栓。大鼠术后24小时，采用Longa评分法评定神经功能，分值在1～3分者入组，死亡鼠予以随机替补。

4.2 分组及给药 将 30 只成模大鼠按随机数字表法随机分为模型组﹑芪仙通络方低﹑中﹑高剂量组﹑丁苯酞组，另设假手术组，共6组，每组各6只，总共36只。于造模后第3天开始灌胃，按70kg成人与动物体质量药量折算，参照大鼠临床等效剂量换算公式[9]，每日按照1ml/100g的给药体积，推算出高﹑中﹑低剂量浓度为31.32g/kg﹑15.66g/kg﹑7.83 g/kg；丁苯酞组予以临床等效剂量0.0054g/kg灌胃。假手术组﹑模型组以相等计量生理盐水灌胃。此外，芪仙通络方各剂量组﹑假手术组﹑模型组还应以等同容积食用油灌胃。所有分组每日灌胃1次。

4.3 神经功能评分测定 在成功造模第3﹑7﹑14天后根据mNSS评分量表进行评分，该表总计18分，神经功能损害程度越高其对应分数越高。

4.4 免疫荧光双标法检测新生血管数量 常规将EDU标记的脑组织脱水﹑透明﹑浸蜡﹑包埋，连续冠状切4μm片；60℃烤片2h，常规脱蜡至水；EDTA（PH8.0）抗原修复23分钟，2mol/L盐酸37℃孵育30分钟，0.1mol/L硼酸漂洗10分钟，3%BSA室温封闭30分钟；分别加入EDU抗体及CD31抗体（1:400），4℃下孵育过夜；室温复温 30 min，PBS洗5 min，反复3次后，滴加FITC标记山羊抗兔IgG（1:100），室温避光孵育1 h；PBS洗5 min，反复3次，滴加 DAPI染色液复染细胞核，室温避光孵育 10 min；PBS洗5 min，反复3次，加入抗荧光衰减封片剂封片后，在荧光显微镜下观察。每张切片随机选取5个缺血侧视野拍照采集图像，采用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件计算单位面积内EDU/CD31双标阳性细胞数，取其平均值进行定量分析。

4.5 免疫组化检测VEGF表达 脑组织切片常规脱蜡至水，EDTA（pH 9.0）抗原修复20 min；在室温下3%双氧水内避光孵育25 min，滴加3%BSA 后室温封闭 30 min；加入VEGF抗体（1:300），4 ℃孵育过夜；滴加HRP标记山羊抗兔IgG（1:500），在室温下孵育50 min，DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水后使用中性树胶封片，置于光学显微镜下观察，以棕黄色颗粒为阳性表达，每张切片随机选取5个缺血侧视野拍照采集图像，采用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件计算VEGF表达的平均光密度（AOD值），进行相对定量分析。

5 统计学方法

结 果

1 芪仙通络方对模型大鼠神经功能评分的影响

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高，且二者差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，芪仙通络方各浓度组及丁苯酞组神经功能评分在第7﹑14日均可见降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与芪仙通络方低﹑中剂量组及丁苯酞组比较，芪仙通络方高剂量组第7﹑14 日的神经功能评分明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2 芪仙通络方对新生血管数量的影响

DAPI染色为蓝色，EDU阳性表达绿色，CD31阳性表达为红色。在模型组和假手术组中均可见EDU/CD31双标阳性细胞，二者相比表达相似，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，芪仙通络方低剂量﹑中剂量﹑高剂量及丁苯酞组双标阳性细胞数目均显著升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；其中高剂量组增加最为明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1﹑表2。

表2 各组大鼠缺血侧EDU/CD31阳性表达均数（±s）个/mm2

表2 各组大鼠缺血侧EDU/CD31阳性表达均数（±s）个/mm2

注：与模型组比较，*P＜0.01；与低剂量组比较，#P＜0.01；与中剂量组比较，▲P＜0.01；与丁苯酞组比较，★P＜0.0

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3 芪仙通络方对VEGF表达的影响

DAB显出的阳性表达为棕黄色，苏木素染细胞核为蓝色。在模型组和假手术组中均可见VEGF表达，二者差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，各给药组VEGF表达显著升高（P＜0.05）；与芪仙通络方低﹑中剂量和丁苯酞组比较，芪仙通络方高剂量组VEGF表达升高最为显著（P＜0.05）。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分比较（±s）

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分比较（±s）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05；与低剂量组比较，☆P＜0.05；与中计量组比较，△P＜0.05；与丁苯酞组比较，●P＜0.05

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表3 各组大鼠缺血侧VEGF阳性表达平均光密度

图2 各组大鼠缺血侧VEGF阳性表达（免疫组化，×200）

4 血管新生数目与神经功能评分和VEGF表达的相关性分析

造模后第14日，采用Pearson相关分析法分析芪仙通络方高剂量组与模型组大鼠缺血区血管新生数目与神经功能评分和VEGF表达的相关性。高剂量组大鼠缺血侧血管新生数目与神经功能评分呈显著负相关（r=-0.84，P＜0.05），与VEGF表达呈显著正相关（r=0.92，P＜0.05），见图3。提示芪仙通络方可能通过上调VEGF表达水平促进血管新生，进而恢复MCAO大鼠缺损的神经功能。

图3 血管新生数目与神经功能评分和VEGF表达的相关性分析

讨 论

目前，现代医学对于急性脑卒中患者药物治疗较为局限，然而中医药对于中风的治疗有着临床可见的成效和其独有的优势。临床研究表明，中药﹑针灸结合康复训练对于卒中后促进患者神经功能﹑自理能力﹑肢体功能﹑智力方面的恢复有明显的改善[10，11]。

国医大师刘祖贻教授结合前世医家经验及多年来临床积累的经验，创立了脑病的“六辨七治”，并提出脑系疾病的主要病因不外乎外邪﹑痰﹑瘀﹑气郁﹑内风﹑正虚[12]。“中风”属中医脑病范畴之一，古往今来，随着中医理论的逐渐挖山，后世医家逐渐认识到中风病机总属脏腑﹑气血﹑阴阳失调。其本为脾肾不足﹑肝肾阴虚，进而导致气血逆乱﹑上冲于脑，标本互为因果，致脑髓空虚，神明失养[13，14]。在此基础上，国医大师刘祖贻教授提出了“脑髓阳生阴长”的理论，刘老认为中风所导致的神经功能缺损的病理基础主要为肾精不足﹑髓海空虚，根据此，刘老创立了芪仙通络方。肾为封藏之本，主藏精，精生髓，上充于脑。脑为髓海，诸髓皆属于脑。阴阳消长，阴随阳长，若肾精需化为脑髓，则需肾中阳气温煦推动肾中阴精，阴阳交感，阴阳二气相互激荡，方可化髓充脑[5]。依据上述理论，本方中以淫羊藿﹑黄芪共为君药，辛﹑甘，温，能补益肾阳，推动肾阴；黄芪，甘，温，可补元气﹑益气扶正，更助淫羊藿补阳生气，二者合用助肾精化髓充脑。枸杞子﹑制首乌，补益肝肾﹑益精，更使髓海充足。再加水蛭﹑丹参﹑山楂等活血通络为助。通过临证反复实践，该方能在较好的安全性下使中风患者的神经功能缺损症状得到良好的改善[5]。本实验结果证明，芪仙通络方无论药物浓度如何，均可使MCAO大鼠神经功能评分下降，促进血管新生，其中又以高剂量组作用最佳，说明芪仙通络方可以促进血管新生并进而改善神经功能缺损。

血管新生在生长发育﹑创伤愈合﹑脑卒中等生理和病理修复过程中发挥着重要作用[15]。研究表明，啮齿动物在缺血后的7天和14天出现血管新生，而人脑早在缺血性损伤后的3天即产生血管新生[16，17]。而临床观察结果显示血管新生与神经功能恢复之间存在相关性，通过血管新生可以改善脑卒中后遗症，促进部分功能的恢复[18]。CD31可在血管内皮中表达，故已成为临床常用的血管生成指标。在本实验中，通过EDU/CD31荧光双标发现芪仙通络方组较模型组EDU/CD31明显上调，提示脑梗死血管损伤后，芪仙通络方可以通过促进血管新生的方式，减轻神经功能缺损症状，其中芪仙通络方高剂量组（31.32g/kg）最为明显。

血管新生受多种因素调控，其中VEGF在缺血性脑卒中后的血管新生过程中常发挥重要作用。其促进血管新生的方式主要是通过引起细胞增殖﹑抑制细胞凋亡﹑增加血管通透性﹑血管扩张﹑招募炎症细胞到损伤部位等反应来完成[19]。VEGF表达上调，提示血管新生，反之，则提示血管新生欠佳。本实验研究表明，与模型组大鼠脑组织的VEGF表达相比较，芪仙通络方组MCAO大鼠脑组织VEGF表达明显上调，显示芪仙通络方在31.32g/kg剂量时表达最高，提示芪仙通络方可通过上调VEGF表达并因此促进血管新生。

综上所述，芪仙通络方能浓度依赖性的改善脑梗死大鼠受损神经功能，其机制可能与上调梗死区VEGF表达而促进血管新生有关。