NR2C2介导的长链非编码RNA LINC00675靶向miR-665调控肝癌细胞生物学行为的机制研究

汪建初，李曙波，陆礼柏，陈益晨，马嘉盛，罗宗将，路远，浦涧

【摘要】 目的 探討研究长链非编码RNA LINC00675对肝癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。

方法 通过qRT-PCR检测LINC00675在肝癌组织以及细胞中表达量，并检测LINC00675在肝癌细胞HepG3与Huh7细胞质及细胞核中的表达分布。通过在HepG3与Huh7中稳定转染慢病毒过表达LINC00675建立细胞模型。通过CCK-8与流式细胞学检测LINC00675对肝癌细胞增殖、凋亡行为的影响，并通过检测细胞模型中葡萄糖摄取量以及乳酸产量变化监测细胞Warburg效应的变化，运用带有AGO2抗体的RNA免疫沉淀技术评估LINC00675与mRNA的潜在结合能力。使用LncBase Predicted v.2 DIANA工具预测LINC00675下游mRNA靶基因。运用RNA pull-down技术检测LINC00675与miR-665结合的可能性。运用荧光素酶实验验证LINC00675与miR-665的靶向结合，共转染实验验证miR-665介导了LINC00675对肝癌生物学行为的影响。通过使用JASPAR数据库预测LINC00675上游调控基因。通过构建NR2C2过表达以及敲低细胞模型，并使用qRT-PCR实验检测细胞模型中的LINC00675表达量的变化。运用荧光素酶实验验证LINC00675启动子与NR2C2的靶向结合位点。

结果 LINC00675在肝癌细胞系中低表达，且主要表达于细胞质中。过表达LINC00675抑制肝癌细胞的增殖能力与Warburg效应，并促进肝癌细胞凋亡。NR2C2介导的LINC00675在肝癌细胞中靶向结合miR-665，负向调控miR-665的表达，并通过结合miR-665来调控肝癌细胞的生物学行为。

结论 NR2C2介导的LINC00675通过靶向结合miR-665调控肝癌细胞的增殖和凋亡的生物学行为。

【关键词】 LINC00675;miR-665;NR2C2;肝癌;增殖;凋亡;Warburg效应

中图分类号：R735.7 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.02.007

A study on mechanism of NR2C2 mediated long non-coding RNA LINC00675 targeting of miR-665 in regulating the biological behavior of HCC cells

[HJ1][HJ]

WANG Jianchu1， LI Shubo2， LU Libai1， CHEN Yichen1， MA Jiasheng1， LUO Zongjiang1， LU Yuan1， PU Jian1

（1. Department of Hepatobiliary Surgery， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;2. Department of Biochemistry of Basic College， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the effect of long non-coding RNA LINC00675 on the biological behavior of HCC cells and its molecular mechanism.

Methods The expression of LINC00675 in HCC tissues and cells was detected by qRT-PCR， and the expression and distribution of LINC00675 in the cytoplasm and nucleus of HCC cells HepG3 and Huh7 were detected.The cell model was established by stably transfecting lentivirus overexpression of LINC00675 in HepG3 and Huh7. The effects of LINC00675 on the proliferation and apoptosis of HCC cells were detected by CCK-8 and flow cytometry， and the changes of Warburg effect were monitored by detecting the changes of glucose uptake and lactic acid production in the cell model， and RNA immunoprecipitation with AGO2 antibody was used to evaluate the potential binding ability of LINC00675 and mRNA. LINC00675 downstream mRNA target genes were predicted by LncBase Predicted v.2 DIANA tool. The possibility of LINC00675 binding to miR-665 was examined by RNA pull-down technology. Luciferase assay was used to verify the targeted binding of LINC00675 to miR-665， and the co-transfection assay was used to verify that miR-665 mediated the effect of LINC00675 on the biological behavior of HCC. The LINC00675 upstream regulatory genes were predicted by using JASPAR database. The NR2C2 overexpression and knockdown cell model were constructed， and the changes of LINC00675 expression in the cell model were detected by qRT-PCR. In addition， the targeted binding site of the LINC00675 promoter to NR2C2 was verified by luciferase assay.

Results LINC00675 was low expressed in hepatoma cell lines and mainly expressed in cytoplasm. Overexpression of LINC00675 inhibited the proliferation and Warburg effect of hepatoma cells， and promoted the apoptosis of hepatoma cells. NR2C2 mediated LINC00675 binded miR-665 in hepatoma cells， negatively regulated the expression of miR-665， and regulated the biological behavior of hepatoma cells by binding miR-665.

Conclusion NR2C2 mediated LINC00675 regulates the biological behavior of proliferation and apoptosis of hepatoma cells by targeting the binding to miR-665.

【Key words】 LINC00675; miR-665; NR2C2; HCC; proliferation; apoptosis; Warburg effect

肝细胞癌是一种全世界范围内高发的恶性肿瘤，在世界上癌症致死的常见原因中位居第四[1]。 据2015年数据统计，肝癌在我国的患病率以及病死率均位居所有恶性肿瘤的前列[2]。由于肝癌具有进展快、转移广等特征，约有70%的病人在首次诊断时已失去手术治疗的机会[3]。肝癌已严重威胁人民的生命健康，也为医疗系统带来了巨大的负担。目前迫切需要寻找到肝癌新的诊断和治疗靶点。长链非编码RNA作为非编码RNA的一种，在过去几十年已经被广泛研究。功能上，长链非编码RNA参与调节了多种细胞的生物学行为，包括增殖、迁移、侵袭、凋亡等[4～8]。机制上，长链非编码RNA可通过靶向结合下游信使RNA，并在转录水平调控基因表达。此外，长链非编码RNA还可通过与蛋白直接结合发挥作用[9～11]。长链非编码RNA在各种疾病的发生发展中发挥了关键的作用。LINC00675已被发现参与了多种肿瘤的发生发展过程，包括卵巢癌[12]、胰腺癌[13]、胃癌[14]等。然而，LINC00675是否参与了肝细胞癌的发生发展尚不可知。本研究首先探究了LINC00675在肝癌细胞中的表达，然后通过慢病毒转染过表达LINC00675在肝癌细胞中的表达量，检测低表达LINC00675对肝癌细胞增殖和凋亡能力的研究，并探究了其中的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

实验中所使用的16例肝癌组织获取于右江民族医学院附属医院肝胆外科在2018至2019年所进行肝癌部分切除术的病人。实验所使用肝癌细胞系293T工具细胞、人肝细胞LO2购于中国科学院上海细胞库。DMEM培养液采购于美国HyClone公司;胎牛血清采购于美国Gibco公司;CCK-8与AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒购于上海碧云天公司;过表达慢病毒、小干扰RNA与miRNA质粒购于上海吉凯公司; Lipofectamine 3000试剂盒购于美国Invitrogen 公司;实时定量PCR实验所使用TRIzol试剂、PrimerScript RT Master以及SYBR premix Ex Taq试剂盒购于日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 临床组织样本

肝癌组织和相邻的癌旁组织样本（距离肿瘤组织>3 cm）取自2018至2019年在本院进行肝癌手术的16例病人。所有组织均经过病理学鉴定，样本研究获得患者同意并签署知情同意书。样本组织切除后即刻保存于液氮中以备后续研究。本研究中所涉及肝癌组织样本实验已通过右江民族医学院附属医院伦理委员会批准。LINC00675在癌与癌旁组织中的表达量通过实时荧光定量PCR实验检测完成。

1.2.2 细胞培养与转染

将肝癌细胞放置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2的培养箱中培育、传代。当培养皿中的细胞融合度达到60%左右时，对细胞进行LV-LINC00675，以及miRNA转染，并将NC空载体作为阴性对照。通过使用lipofectamine 3000试剂盒完成细胞转染，在转染2天后，提取RNA进行检测。慢病毒质粒、小干扰RNA以及miRNA质粒由上海吉凯公司构建提供。

1.2.3 PCR定量

使用TRIzol提取细胞中的RNA，使用PrimerScript RT Master（Takara）試剂完成RNA逆转录为cDNA过程，使用SYBR premix Ex Taq（TaKaRa）完成PCR扩增，U6作为miRNA内参，GAPDH作为LINC00675内参，使用2-ΔΔCt计算相对表达量。实验中所使用引物如下 （5’到3’），LINC00675：上游 GCCTACTGCTCTGGATCATCTGGTA，下游 TGGCGTACAGGTCTTTGCGG;miR-665：上游 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG，下游 AGGTGCACTGGATACGACAGGGGC;NR2C2：上游 CCTCTGGCCCATTGAGTGTTT，下游 GTCCACTGCGGTGACTATCTG;U6：上游 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA，下游 GGTGCACTGGATACGACAAAATATGG;GAPDH：上游 GGACCTGACCTGCCGTCTAG，下游 GTAGCCCAGGATGCCCTTGA。

1.2.4 荧光原位杂交实验（fluorescence in situ hybridization，FISH）

生物素标记的LINC00675探针由IDT（美国集成DNA技术公司）设计和合成。探针信号由Alexa FluorTM 594 Tyramide SuperBoostTM （Thermo Fisher Scientific）试剂盒依照说明书进行实验检测。

1.2.5 细胞增殖实验

待肝癌细胞稳定转染后，将细胞接种于96孔板中 （每孔细胞量104，并设置三个副孔）。在37℃、5% CO2培养箱中培养24小时，之后加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2小时，在450 nm波长处，使用酶标仪检测吸光度，并计算细胞的增殖/抑制率，实验重复三次。

1.2.6 细胞凋亡实验

将稳定转染肝癌细胞HepG3与Huh7及其阴性对照组细胞分别接种于6孔板中（每孔约105个细胞）培养24小时，用胰蛋白酶消化后使用PBS清洗三次。将细胞悬液调整至100 μL后根据说明书加入定量AnnexinⅤ-FITC和PI，室温避光20分钟，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.7 Warburg 效应检测

根据制造商的说明，使用葡萄糖分析试剂盒（ab65333，英国剑桥Abcam）和乳酸分析试剂盒（ab65330，英国剑桥Abcam）对葡萄糖消耗和乳酸产生进行分析。使用微孔板读取器检测570 nm处的吸光度。

1.2.8 RNA免疫共沉淀

RNA免疫共沉淀根据Magna RIP RNA-binding protein immunoprecipitation kit （Millipore， Germany）说明书进行实验，实验中加入AGO2抗体以及IgG抗体，通过PCR检测蛋白沉淀物中的目的RNA表达。

1.2.9 RNA pull-down实验

将全长的LINC00675序列交予上海吉凯公司进行Biotinylate标签化，转染细胞后，取细胞裂解液与C-1磁珠 （Life Technologies， USA）共同孵育，形成磁珠-探针复合物，使用PCR技术探测复合物中目的RNA的表达量。

1.2.10 双荧光素酶实验

将野生型（WT）与突变型（Mut）LINC00675序列插入pGL4.74载体中，构建荧光素酶质粒，并与miR-665 mimic质粒或NR2C2过表达慢病毒共同分别转染至细胞中，24小时后使用荧光素酶报道系统检测细胞荧光素酶活性，并记录结果，实验重复三次。

1.3 统计学方法

本实验采用SPSS 16.0统计软件对实验结果进行统计分析，使用student t-test对两组结果之间的差异进行显著性分析，使用One-way ANOVA方法对多组实验结果之间的差异进行显著性分析。实验结果以（±s）表示，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结 果

2.1 LINC00675在肝癌组织以及细胞系中的低表达

首先我们探究了LINC00675在肝癌组织以及细胞系中的表达情况，结果显示，与癌旁组织相比较，LINC00675在癌组织中表达降低 （P<0.05），见图1A。与正常肝细胞LO2相比较，LINC00675在肝癌细胞中普遍低表达，且在肝癌细胞HepG3和Huh7中表达最低（P<0.01），见图1B。之后我们检测了LINC00675在肝癌细胞HepG3和Huh7的细胞质以及细胞核中的表达量，结果显示LINC00675在细胞质中高表达， 但在细胞核中低表达（P<0.001），见图1C与D。为进一步研究LINC00675在肝癌细胞中的功能，我们通过将LV-LINC00675及其阴性对照组（LV-NC）转染至HepG3和Huh7细胞中，结果显示LV-LINC00675明显提升了LINC00675在HepG3和Huh7中的表达（P<0.01），见图1E。

2.2 LINC00675过表达抑制肝癌细胞的增殖与Warburg效应并促进细胞凋亡

我们通过构建稳定高表达的LINC00675细胞HepG3和Huh7进行功能学研究，CCK-8结果显示，与阴性对照组（LV-NC）相比较，细胞HepG3和Huh7在过表达LINC00675后的细胞增殖能力明显降低（P< 0.05），见图2A和B。而与阴性对照组（LV-NC）相比较，HepG3和Huh7细胞的凋亡现象在LINC00675过表达之后显著增高（P<0.05），见图2C和D。此外，过表达LINC00675显著抑制了肝癌细胞葡萄糖的摄取量以及乳酸的产量（P<0.01），见图2E和F。

2.3 LINC00675靶向结合miR-665

为探究LINC00675调控肝癌细胞增殖和凋亡现象背后的分子机制，我们对LINC00675下游分子進行了探究。AGO2-免疫共沉淀实验结果显示，与对照组IgG抗体对比，LINC00675与AGO2抗体大量结合，表明LINC00675可能与miRNA结合（P<0.001），见图3A。通过使用生物信息网站LncBase Predicted v.2 DIANA工具，我们发现mircoRNA miR-655是LINC00675的潜在靶基因，结合位点见图3B。之后我们进行了RNA pull-down实验，结果显示相比于阴性对照组（Bio-NC探针），miR-655大量聚集于Bio-LINC00675探针（P<0.001），见图3C。双荧光素酶报告基因实验结果显示在293T工具细胞以及肝癌HepG3细胞中，WT组LINC00675能够与miR-665结合（P<0.01），见图3D和E。我们对LINC00675是否影响miR-665的表达进行了探究，在HepG3和Huh7细胞中过表达LINC00675（OE-LINC）显著降低了miR-665的表达（P<0.001），见图3F。

2.4 LINC00675通过靶向miR-665调控肝癌细胞的生物学行为

为了探究miR-665是否参与了LINC00675调控肝癌细胞增殖和凋亡的过程，我们进行了共转染实验，并对转染效率进行了检测，见图4A。CCK-8实验结果显示，过表达miR-665减轻了LINC00675过表达对肝癌细胞HepG3和Huh7增殖能力的抑制作用（P<0.05），见图4B和C;过表达miR-665后， LINC00675过表达的肝癌细胞HepG3和Huh7的凋亡现象也发生了减弱（P<0.05），见图4D和E。此外，miR-665过表达反转了LINC00675过表达对于肝癌细胞Warburg效应的抑制作用（P<0.01），见图4F和G。

2.5 NR2C2介导LINC00675在肝癌细胞中的表达

通过以上实验结果，我们探究了LINC00675在肝癌细胞中的生物学功能及其下游的分子机制。然而LINC00675的上游分子机制仍不清楚，我们通过使用JASPAR（http：//jaspar.genereg.net/）數据库预测LINC00675的上游转录因子，发现核受体亚家族2 C组成员2（Nuclear Receptor Subfamily 2 Group C Member 2，NR2C2）蛋白可能调控LINC00675启动子转录。我们构建了NR2C2的稳定过表达以及敲低细胞模型，qRT-PCR实验结果显示LINC00675在肝癌细胞中的表达被NR2C2正向调控（P<0.01），见图5A和B。NR2C2在LINC00675启动子上的靶基序列以及可能靶向的LINC00675启动子序列在JASPAR数据库上获得，见图5C和D。此外，双荧光素酶报告基因实验结果显示数据库所预测的LINC00675启动子上的三个靶标（P1、P2和P3）都可以与NR2C2结合（P<0.01），见图E和F。

3 讨 论

本研究首先发现了LINC00675在肝癌组织以及多种肝癌细胞系中的低表达，且发现LINC00675主要表达于肝癌细胞的细胞质中，这些结果表明，LINC00675可能参与调控了肝癌细胞生物学行为。之后，我们通过使用肝癌细胞HepG3和Huh7构建LINC00675稳定过表达的细胞模型，并进行了功能学检测，发现HepG3和Huh7细胞在过表达LINC00675之后，其细胞增殖能力以及细胞中的Warburg效应明显减弱，而细胞凋亡现象明显增强。LINC00675在多种恶性肿瘤中也被发现表达失调，并参与调控了细胞的增殖、迁移、侵袭，以及肿瘤转移的过程，且其在肿瘤组织内的表达量与病人预后密切相关[15～18]。本实验结果显示LINC00675参与调控了肝癌细胞的生物学功能，并首次发现LINC00675参与调控了肝癌细胞Warburg效应。

miR-665已被报道通过靶向PTPRB后降低Hippo信号通路的蛋白表达，从而促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[19]。外泌体miR-665在肝癌病人体内的表达水平被证实可以作为独立的诊断和预后因素[20]。此外，miR-665作为环状RNA circABCC2的下游靶分子，调控肝癌细胞的增殖、侵袭和凋亡[21]。以上研究显示，miR-665分别通过自身表达量改变，外泌体形态，以及作为环状RNA的靶基因参与了肝癌细胞的生物学行为调控，表明miR-665在肝癌发生发展过程中的重要作用。本研究首先通过AGO2 免疫共沉淀实验评估了LINC00675与miRNA的结合能力，之后运用生物信息数据库预测LINC00675的miRNA靶基因，在RNA pull-down以及双荧光素酶报告基因实验证实LINC00675靶向结合miR-665。通过功能学实验验证，本研究发现LINC00675通过靶向结合miR-665，并负向调控miR-665的表达，调控了肝癌细胞的增殖和凋亡。此外，本研究结果表明LINC00675在肝癌细胞中的表达可被NR2C2转录调控。

本研究部分阐述了LINC00675在肝癌发生发展过程中的生物学功能以及上游及下游的直接分子机制。然而，LINC00675的临床意义以及表达特征仍需足够数量的肝癌样本进行深入分析。此外下游的蛋白机制及分子通路仍待进一步探索研究，进而更加明确地阐述在肝癌发生发展过程中LINC00675发挥生物学功能背后的具体分子机制。

综上所述，本研究发现LINC00675在肝癌细胞中普遍低表达，NR2C2诱导的LINC00675通过靶向结合miR-665调控了肝癌细胞的生物学行为，根据以上实验结果推测LINC00675可能作为肝癌诊断以及治疗研究的新靶点，并为肝癌的分子治疗研究提供新的策略。

参 考 文 献

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（收稿日期：2021-08-27 修回日期：2021-11-03）

（編辑：潘明志）