木聚糖酶生产菌Saccharothrix variisporea YJ的筛选、发酵条件及酶学性质研究

姚 健， 吁 安， 龙 云， 桂 伦， 陈莎莎， 沈爱喜， 康美花*

(1.江西省农业科学院 农业应用微生物研究所，江西 南昌 330200;2.江西省农业科学院 植物保护研究所，江西 南昌 330200)

作为半纤维素的主要组成成分之一，木聚糖在自然界中分布十分广泛。例如在农业废弃物玉米芯、麦麸、米糠、秸秆及甘蔗渣中木聚糖的含量非常高，仅次于纤维素[1-2]。木聚糖的结构极其复杂，含有不同的取代基，但其主链是由 β-1,4-糖苷键连接β-D-吡喃型木糖构成[3]。木聚糖的降解需要多种不同的酶共同参与，包括β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.3.1.37)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)等[4]。β-1,4-内切木聚糖酶是半纤维素降解过程中关键酶之一[5-6]，其应用非常广泛，在制浆造纸[7-12]、食品[13-14]、饲料添加剂[15-16]及生物转化[17-19]等方面都起重要作用。木聚糖酶在自然界中分布广泛，在微生物、藻类、植物组织、甲壳动物以及无脊椎动物中均有发现[20]。迄今为止，微生物源的木聚糖酶如链霉菌属(Streptomyces)[18]、芽胞杆菌属(Bacillus)[12]、毛壳菌属(Chaetomium)[6]、木霉属(Trichoderma)及曲霉属(Aspergillus)等[20]研究得较为深入。目前，木聚糖酶的研究主要侧重于木聚糖酶生产菌株的筛选及选育[21-22]、发酵条件的优化[23-24]，木聚糖酶基因的克隆及工程菌的构建[25-26]等方面。尽管已经从不同的环境中筛选到了大量的木聚糖酶生产菌株，但不同的环境对酶的使用要求不同，因此开发适用于不同用途的木聚糖酶仍有必要。由于刚果红染色法存在着操作繁杂、菌株间易混杂以及假阳性的问题，为此本研究利用双层平板法，以Azo-xylan为底物从堆肥中筛选到了可降解木聚糖的菌株，并对该菌株进行分子鉴定及产木聚糖酶发酵条件优化，同时对木聚糖酶的酶学性质进行了初步研究，为今后构建木聚糖酶工程菌及利用农业废弃物生产低聚木糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 样品来源于猪粪与甘蔗叶混合发酵的堆肥，其发酵时间为3 d，温度为40 ℃，初始C/N 比和pH值分别为25∶1和8.0，含水率为60%[21]。

1.1.2 培养基 生长培养基(g/L)：蔗糖10，NaNO32.0，K2HPO41.0，KCl 0.5，MgSO40.5，FeSO40.01，琼脂粉15，H2O定容至1 L，115 ℃灭菌25 min；筛选培养基(g/L)：琼脂粉10，Azo-xylan 200 mL，NaH2PO4-Na2HPO4buffer(0.02 mol/L，pH值8.0)定容至1 L；产酶培养基(g/L)：(NH4)2SO42.0，K2HPO41.0，KCl 0.5，MgSO40.5，FeSO40.01，甘蔗叶12(过60目筛)，pH值 7.0，H2O定容至1 L， 121 ℃灭菌25 min[21]。

1.1.3 主要试剂及仪器设备 基因组提取试剂盒(TianGen)；Azo-xylan(Birchwood，Megazyme)。离心机(Eppendorf 5804R，德国)；酶标仪(Spectra MAX190，美国)；电泳仪(DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司)；高压灭菌锅(Hirayama HVA-85，日本)；梯度PCR仪(S1000TM，Bio-rad，德国)。

1.2 方法

1.2.1 菌株筛选 取样品溶于无菌水，梯度稀释，涂布于生长培养基，35 ℃倒置培养4 d，加筛选培养基，继续培养1 d，加2 mL乙醇(95%)，放置5～10 min，挑取有水解圈的菌落，划线培养获得单一菌株[21]。

1.2.2 菌株鉴定 利用基因组试剂盒提取细菌基因组DNA。以细菌基因组DNA为模板，PCR扩增其16S rDNA：25 μL体系，12.5 μL PrimerSTAR Max(2×)，0.5 μL模板基因组DNA，引物(5′-AAATTTTTTTTCCCCCCCGG-3′)和(3′-GGGCCCCCTTTAAAAAAAAAC-5′)各0.5 μL(10 μmol/L)，11 μL 无菌水；PCR扩增：98 ℃，4 min；98 ℃，15 s；55 ℃，15 s；72 ℃，30 s，30个循环，72 ℃延伸10 min，PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3 木聚糖酶活性测定 取100 μL发酵液，加入100 μL 1% Azo-xylan，40 ℃放置10 min，8 000 r/min离心5 min，加入500 μL 95%乙醇，室温放置5 min后测吸光值(590 nm)。

1.2.4 发酵生产木聚糖酶的条件优化 挑取已纯化好的菌株，接种至生长培养基中160 r/min、35 ℃过夜培养。①氮源优化: 选取0.2%(质量分数)的酵母提取物、NaNO3、(NH4)2SO4、牛肉膏和蛋白胨作为唯一氮源，160 r/min、40 ℃培养5 d，按1.2.3方法测酶活性。②碳源优化: 玉米芯、甘蔗叶、稻草和麦麸作为唯一碳源，40 ℃、160 r/min 震荡培养5 d，按1.2.3方法测酶活性。③不同甘蔗叶浓度对木聚糖酶活性的影响：称取甘蔗叶使其终浓度分别为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%(质量分数)，然后将培养基pH值调整为7.0，40 ℃、160 r/min培养5 d，按1.2.3方法测酶活性。④温度选择：在25～45 ℃之间每隔5 ℃选取一个点作为培养温度，5 d后按1.2.3方法测酶活性。⑤pH选择：选取6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0分别作为菌株培养的初始pH，40 ℃培养5 d，按1.2.3方法测酶活性。⑥培养时间优化：在氮源、碳源及浓度、温度和初始pH最优基础上，每隔24 h取样，按1.2.3方法测酶活性。

1.2.5 木聚糖酶酶学性质分析 ①最适反应温度：100 μL发酵液中加入100 μL 1% Azo-xylan，分别在30～65 ℃的条件下水浴10 min，然后按1.2.3方法检测其最适反应温度(最高酶活性记为100%)。②最适反应pH：调整发酵液pH值分别至6.0～8.0(0.1 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4buffer)、7.5～9.0(0.1 mol/L Tris-HCl buffer)、8.5～10.0(0.1 mol/L glycine-NaOH buffer)，加入相同体积的1% Azo-xylan，55 ℃水浴10 min，然后按1.2.3方法检测其最适反应pH(最高酶活性记为100%)。③温度稳定性及pH稳定性：在55 ℃及pH值 8.0条件下，通过测定发酵液分别在30～75 ℃下水浴3 h后的剩余酶活性来明确温度稳定性；通过测定发酵液在pH值 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0条件下放置30 min(在55 ℃及pH值 8.0条件下)的剩余酶活性，确定pH稳定性。4 ℃条件下保存的发酵液酶活性定义为100%。④金属离子对酶活性的影响：取47.5 μL发酵液，分别加入2.5 μL 0.1 mol/L的金属离子(Ca2+、Fe2+、Mg2+、 Mn2+、Zn2+、Cu2+和Na+)，室温放置30 min，55 ℃及pH值 8.0条件下测剩余酶活性；取45 μL粗酶液，分别加入5 μL 0.1 mol/L上述金属离子，室温放置30 min，55 ℃及pH值 8.0条件下测其剩余酶活性，以未加金属离子的酶活性定义为100%；⑤发酵液对玉米芯的降解：a.发酵液对玉米芯木聚糖的降解：称取1.5 g玉米芯，加入30 mL 15%的NaOH，80 ℃水浴90 min，调节pH至5.0，过滤，所得沉淀(即为玉米芯木聚糖)放入培养皿中烘干过夜，称重并记录；称取0.05 g玉米芯木聚糖，加入1.0 mL发酵液，55 ℃条件下放置6 h后，取200 μL 反应液，加入200 μL DNS，沸水浴10 min，分光光度计520 nm检测吸光值；b.发酵液对玉米芯的降解：称取玉米芯(150目过筛)0.05 g，加入1.0 mL的发酵液，55 ℃条件下放置6 h，取200 μL 反应液，加入200 μL DNS，沸水浴10 min，分光光度计520 nm检测吸光值。

2 结果与分析

2.1 产木聚糖酶菌株的筛选

以Azo-xylan为底物进行木聚糖酶生产菌株的筛选，结果如图1A所示，木聚糖酶生产菌会生成明显的透明圈。挑取酶活性较大的菌株再次培养进行验证，结果如图1B所示，菌落周边发现有明显的水解现象。

图1 木聚糖酶生产菌株的筛选Fig.1 Screening of xylanase producing strainsA：菌株分离；B：菌株纯化A：Isolation of bacteria;B:Purification of bacteria

2.2 菌株鉴定

以筛选到的菌株基因组DNA作为模板，PCR扩增得到该菌株的16S rRNA，经测序显示该片段长度为1 338 bp。将该序列提交到GenBank数据库进行比对，发现糖丝菌属(Saccharothrix)与该菌株具有最高的同源性(99%)。系统发育树构建结果显示该菌株与Saccharothrixvariisporea进化距离最近，同源性为99.33%(图2)，故将该菌株初步定义为Saccharothrixvariisporea，命名为SaccharothrixvariisporeaYJ(保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号：60442)。

图2 基于16S rRNA构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA

2.3 木聚糖酶的发酵条件优化

2.3.1 氮源和碳源优化 选用酵母提取物、NaNO3、(NH4)2SO4、牛肉膏和蛋白胨五种物质作为氮源，从中优选氮源。结果表明酵母提取物和(NH4)2SO4作为氮源的培养基中所产木聚糖酶活性最高，其次为NaNO3和牛肉膏，蛋白胨相对最低，仅为最高酶活性的54.3%(图3A)；在微生物生长代谢过程中，碳源作为主要能量来维持细胞生命活动。大多数微生物生产的木聚糖酶是复合酶，也是诱导酶，其诱导底物多为半纤维素及其类似物，而不同底物对木聚糖酶的诱导水平存在差异性。为此，选用农业废弃物玉米芯、甘蔗叶、稻草和麦麸作为原料研究其最适合碳源。结果显示不同的碳源对SaccharothrixvariisporeaYJ生产木聚糖酶的酶活性存在着明显差异，甘蔗叶作为碳源的培养基中木聚糖酶活性最高，玉米芯最低，仅为最高值的43.1%(图3B)。这可能是由于该菌株来源于甘蔗叶堆肥发酵物，对甘蔗叶作为碳源的适应性较高，因此甘蔗叶作为碳源时该菌株产生的木聚糖酶活性最高。其次，培养基中碳源浓度对菌株产让木聚糖酶也有一定的影响，进一步对甘蔗叶的添加量进行了优化，发现甘蔗叶为1.2%(质量分数)时，发酵液中木聚糖酶的酶活性最高；2.0%时酶活性较低，为最高酶活性的78.5%，培养基中甘蔗叶为0.2%～0.8%，其发酵液中木聚糖酶的酶活性略低于最高值(图3C)。因此选用1.2%(质量分数)的甘蔗叶作为木聚糖酶最适发酵碳源。

2.3.2 发酵pH、温度及时间对酶活性的影响 如图3D所示，初始pH值为7.0时，发酵液木聚糖酶酶活性最高，pH值为 6.6～7.0时，发酵液酶活性均高于最高酶活性的90%；而pH值高于7.0，酶活性随pH的升高而迅速降低，pH值为 9.0时，仅为最高值的51.2%。此外，培养温度及时间对酶活性也有影响，40 ℃时，木聚糖酶酶活性最高，随着培养温度的升高酶活性迅速降低(图3E)。选择1、2、3、4、5、6 d确定最适宜发酵时间。研究结果表明，随着培养时间的延长，木聚糖酶酶活性先迅速升高再趋于平稳，培养2 d时，其酶活性迅速升高并在5 d后达到最高值，其后发酵液酶活性缓慢降低(图3E)。综上所述，该菌株发酵生产木聚糖酶的最佳发酵条件为酵母提取物或(NH4)2SO4为氮源(0.2%)(质量分数)、甘蔗叶为碳源(1.2%)(质量分数)、初始pH值7.0、培养温度为40 ℃，培养时间为5 d。

图3 发酵条件优化Fig.3 Optimization of fermentation conditionsAA：氮源优化；B：碳源优化；C：碳源浓度优化(质量分数)；D：初始pH优化；E：发酵温度优化(℃)；F：发酵时间优化A：Optimization of nitrogen sources;B:Optimization of carbon sources;C:Optimization of carbon source concentration(w/v);D:Optimization of initial pH;E:Optimization of fermentation temperature(℃);F:Optimization of fermentation time

2.4 木聚糖酶的酶学性质分析

2.4.1 最适反应温度及温度稳定性 通过测定在30～65 ℃条件下发酵液中木聚糖酶的活性，来确定其最适反应温度。图4A显示，在检测范围内，发酵液中木聚糖酶的酶活性呈现先升高后降低，55 ℃时达到最高值。对发酵液中木聚糖酶的温度稳定性研究发现，该酶在温度低于或等于55 ℃时，其酶活性没有明显的变化，具有很高的稳定性，但当温度升高至65 ℃时，其稳定性急剧下降，3 h后酶活性基本丧失(图4B)。

图4 温度对酶活性的影响Fig.4 Effect of temperature on xylanase activity A：最适反应温度；B：温度稳定性A：Optimal reaction temperature;B:Temperature stability

2.4.2 最适反应pH及pH稳定性 在pH值 6.5～10.0之间测发酵液中的酶活性，结果显示当pH值为 6.5～9.5时发酵液中的木聚糖酶保持较高的酶活性。pH值 8.0时达到最大值，随着pH值的升高酶活性迅速降低(图5A)。对发酵液中木聚糖酶的pH稳定性研究发现，木聚糖酶活性在pH值 4.0～10.0的范围内均保有较高的稳定性，处理30 min后，酶活性仍在90%以上(图5B)。

图5 pH对酶活性的影响Fig.5 Effect of pH on xylanase activity A：最适应反应pH;B:pH稳定性A:Optimal reaction pH;B:pH stability

2.4.3 金属离子对酶活性的影响 金属离子对酶的生物活性有着重要的影响。分别在发酵液中添加终浓度为0.005 mol/L和0.01 mmol/L的Ca2+、Fe2+、Mg2+、 Mn2+、Zn2+、Cu2+和Na+等金属离子，发现Na+能有效提高木聚糖酶活性，0.01 mol/L Na+使木聚糖酶活性提高了0.2倍，Mg2+和Mn2+对木聚糖酶活性没有明显的影响，Ca2+、Fe2+和Cu2+明显抑制木聚糖酶活性，Cu2+对木聚糖酶活性抑制最强(其酶活性仅为原来的6%左右)，其次为Fe2+和Ca2+(图6)。

图6 金属离子对酶活性的影响Fig.6 Effect of metal ions on enzyme activity

2.4.4 木聚糖酶对玉米芯的降解 经碱性溶液处理后，1.5 g玉米芯可得到0.1 g玉米芯木聚糖；0.05 g玉米芯木聚糖经发酵液中木聚糖酶处理6 h，得到1.33 mg还原糖，即1.5 g玉米芯中还原糖的得率为0.177%。另外，研究发现发酵液中木聚糖酶可以直接对玉米芯(150目)进行降解，0.05 g玉米芯经6 h处理，能够获得0.88 mg的还原糖(得率为1.76%)，其得率是经过碱提取处理玉米芯获取还原糖的10倍。

3 讨 论

在农业种植及生产过程中会产生大量的废弃物，农作物秸秆作为主要副产物，其产量巨大。据统计2019年全国主要农作物秸秆产量高达861万t[27]，其中大部分秸秆被焚烧或者随意丢弃，不仅造成资源浪费，还会造成环境污染[28]。农作物秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素及木质素等纤维素类物质，此类物质是影响农作物秸秆有效利用的主要因素。木聚糖是半纤维素的主要组成部分，介于纤维素和木质素之间，维持纤维抱合力和细胞壁结构的完整性，所以木聚糖酶对木质纤维素的降解有至关重要的作用[29]。半纤维素预处理的方法主要有化学法、物理法和生物法。其中物理法和化学法不仅能耗高，还会对环境造成不同程度的污染[27]；而生物法具有能耗低、环境友好等特点受到广大科研工作者的关注，从不同环境中获得了一些降解半纤维素能力较强的菌株。刚果红染色法是筛选木聚糖酶生产菌株的主要方法，但刚果红染色法存在操作繁琐及假阳性问题，增加了菌株筛选的工作量。本研究以Azo-xylan作为筛选底物，利用双层平板筛选木聚糖酶生产菌株，操作简单省时，也可以避免假阳性的出现。本研究利用该方法成功地从猪粪与甘蔗叶混合堆肥中筛选到一株木聚糖酶生产菌株，经16S rDNA测序鉴定初步将该菌株鉴定为Saccharothrixvariisporea，并命名为SaccharothrixvariisporeaYJ。其发酵产酶条件研究发现，酵母提取物或(NH4)2SO4作为氮源，初始pH为7.0，40 ℃培养5 d，其木聚糖酶活性最高。该结果与何敏超等和曹慧等的研究结果略有不同。何敏超等[30]研究发现(NH4)2SO4作为氮源，黑曲霉SM24/a木聚糖酶酶活性最高，而酵母粉作为氮源时木聚糖酶酶活性最低，发酵初始pH值为5.0时，木聚糖酶活性最高；曹慧等[29]研究发现Neurosporacrassa产木聚糖酶的最适发酵温度为33 ℃，初始pH值为8.0。酶学性质研究发现SaccharothrixvariisporeaYJ木聚糖酶的最适反应温度为55 ℃，高于黑曲霉SM24/a木聚糖酶(37 ℃)[30]和Neurosporacrassa木聚糖酶(50 ℃)的最适反应温度[29]。在不高于55 ℃和pH值 4.0～10.0的范围时，SaccharothrixvariisporeaYJ木聚糖酶保持很高的稳定性，该结果与马焕等[31]的研究结果类似。Na+能有效提高SaccharothrixvariisporeaYJ木聚糖酶的活性，而Mg2+和Mn2+对其酶活性没有明显的影响，Ca2+可以轻微地抑制其酶活性；该结果与芽胞杆菌MS12木聚糖酶的性质不同，Na+、Mg2+和Ca2+对芽胞杆菌MS12木聚糖酶的活性有促进作用[31]。此外，该菌株发酵液可以直接(不需要经过碱提取木聚糖)对天然底物玉米芯进行降解，经过6 h的处理后，可以从0.05 g玉米芯获得0.88 mg的还原糖，是经过碱提取处理玉米芯获取还原糖的10倍。该酶的最适温度、pH、稳定性以及对天然底物的降解特点使得该酶在酶解处理木质纤维素方面具有良好的应用潜力。