氯化铜[64Cu]溶液放射化学纯度的TLC测定方法研究

王晓明 陈孟毅 吴福海 温 凯 赵海龙 周佳骏 李洪玉

（原子高科股份有限公司 北京 102413）

64Cu 核素具有适宜的正电子能量（0.653 MeV）和半衰期（12.7 h），可以对多肽、小分子、抗体等进行标记制备正电子发射计算机断层显像（Positron Emission Computed Tomography，PET）药物，或作为诊疗一体化的配对核素，进行神经内分泌肿瘤、前列腺癌等疾病的诊断及治疗［1−7］。在药物标记过程中64Cu 核素主要以氯化铜［64Cu］溶液为原料载体，目前已实现国产化批量生产［8−9］，可满足国内科研医疗机构的研究应用。氯化铜［64Cu］溶液作为一种药用原料，其质量控制对药品的安全性、有效性具有重要意义，而放射化学纯度是放射性药品及核素前体质量标准的一个关键项目，开发满足药品检验技术要求的分析方法是非常必要的。

放射化学纯度测量方法主要为色谱法，包括薄层色谱法（Thin-layer Chromatography，TLC）及高效液 相 色 谱 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。其中TLC 法在放射性药品生产检验中应用最为广泛，具有快速检验和操作简便等优点；HPLC虽然在检测准确度、精密度方面更具优势，但由于放射性药物通常有效期较短，而HPLC 分析所需时间较长，需配备相应检测设备及对操作人员要求较高，因此使HPLC 在实际应用中存在一定局限性。与氯化铜［64Cu］溶液类似的氯化镓［68Ga］溶液和氯化镥［177Lu］溶液，欧洲药典收录的放射化学纯度的检测方法均为TLC 法［10−11］，该方法通 过 增 加 对 二 乙 烯 三 胺 五 乙 酸（Diethylenetriaminepentaacetic Acid，DTPA）络合离子为参比样品的测试，实现放射性金属离子与其络合物在测试条件下的分离，并且分离度满足系统适用性的要求，以此确认方法对待测放射性金属离子检出的有效性。

目前，各国药典均未收录氯化铜［64Cu］溶液的质量标准，文献中对氯化铜［64Cu］溶液的质量研究亦少见报道。其放射化学纯度的TLC 法主要以0.1 mol∙L−1柠檬酸钠或乙酸乙酯［12−14］为展开剂，缺少对系统适用性的考察。本文在前期研究的基础上［15］，通过对多种常用固定相和流动相条件的筛选，以及对参比样品配制条件的摸索，确定了满足系统适用性的氯化铜［64Cu］溶液放射化学纯度的TLC测试方法。

1 试验部分

1.1 主要仪器

AR-2000型放射性薄层扫描仪：美国BIOSCAN公司。

1.2 主要材料与试剂

甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、盐酸、二乙烯三胺五乙酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；iTLC-SG 玻璃微纤维硅胶色谱纸，美国Agilent Technologies公司；Whatman No.1色谱纸，美国Whatman 公司；铝基硅胶板，美国Merck 公司；聚酰胺制薄膜，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂。

1.3 实验方法

1.3.1 放射化学纯度分析方法的建立

样品制备：取适量氯化铜［64Cu］溶液（0.001~0.010 mol∙L−1HCl 体系），以氯化铜［64Cu］溶液体系相同浓度的HCl 溶液稀释至放射性浓度约为37 MBq∙mL−1，为供试品溶液；取供试品溶液，按一定比例加入DTPA 的NaOH 溶液，混合均匀，为参比溶液。

操作方法：在固定相一端1.5 cm处点样，晾干后置于盛有展开剂的展开缸中，保持点样点处于展开剂液面之上，使样品按上行色谱法进行分离，展开剂展开约10 cm 后取出固定相，悬挂晾干后以放射性薄层扫描仪测量放射性谱峰计数，计算放射化学纯度和Rf值，根据谱峰峰型、Rf值、参比主峰与供试品主峰分离度情况，筛选合适的测试条件。

测试条件筛选实验：

1）固定相及流动相筛选，在9 g∙L−1NaCl 溶液（pH 2.30±0.05）、不同比例甲醇-77 g∙L−1乙酸铵、不同比例的乙腈-水、不同比例丙酮-水、乙酸乙酯、二氯甲烷-乙腈-甲醇-水相混合体系等展开剂条件下，并以盐酸调节流动相pH，考察供试品及参比溶液在不同固定相的展开情况。

2）展开剂组分比例优化，以二氯甲烷、乙腈、甲醇、不同浓度HCl溶剂配制展开剂，比较各组分不同比例、不同盐酸浓度的展开剂对供试品及参比溶液的测试结果，供试品主峰应具有良好峰型，与参比主峰的分离度大于1.0。

3）参比溶液参数优化，配制10 g∙L−1DTPA（4 g∙L−1NaOH）、20 g∙L−1DTPA（11 g∙L−1NaOH）和4 g∙L−1NaOH溶液，与供试品溶液按不同比例混合，测试此条件的参比溶液，考察参比溶液中生成的64Cu-DTPA络合物主峰峰型及Rf值。

方法应确保供试品的放射化学纯度不小于95%的限度标准，系统适用性要求供试品与参比主峰分离度R大于1.0，并具有良好的放射性谱峰峰型。分离度的计算公式为：

式中：d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离，mm；d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离，mm；W1和W2为相邻两峰各自的峰宽，mm。

1.3.2 样品检验

进行三批次氯化铜［64Cu］溶液的放射化学纯度测试，确认分析方法适用于常规产品的质量检验。

2 结果与讨论

2.1 放射化学纯度分析方法的建立

1）固定相与展开剂的初步筛选：本阶段实验以筛选条件为目的，主要关注谱峰峰型及分离度。表1 列出了具有代表性的测试条件及结果，其中Rf小于0.1，代表谱峰处于点样原点范围，大于0.9，代表谱峰处于溶剂展开顶端。在实验的展开剂中，Whatman No.1 色谱纸相比iTLC-SG 硅胶色谱纸主要存在展开时间长、不易晾干等问题，且未获得相对较优结果，因此后续条件筛选中固定相以iTLC-SG硅胶色谱纸为主。表1 中第4、5 两个条件分别为欧洲药典氯化镥［177Lu］溶液和氯化镓［68Ga］溶液放射化学纯度分析方法，实验在此基础上进行了变更固定相及流动相比例等条件实验，但存在供试品与参比主峰无法分离、双峰或多峰、拖尾等现象。以丙酮、丙酮-水（pH 2.0）、乙酸乙酯为展开剂，主要存在双峰、拖尾及展开时间较长等问题；以乙腈-水（pH 1.0）为展开剂时，供试品与参比主峰位置大致相同，说明展开剂极性偏大，无法实现Cu2+离子与Cu-DTPA络合物的分离；替换极性较大的水组分，以二氯甲烷-乙腈为展开剂，供试品与参比主峰峰型较好，但两峰的Rf值相近，未能实现分离。在此基础上加入甲醇，并以0.01 moL∙L−1HCl 溶液调节展开剂酸度，获得了完全分离的、峰型良好的供试品与参比溶液谱峰，完成了测试条件的筛选，谱图如图1 所示。初步确定方法以iTLC-SG 硅胶色谱纸为固定相，以体积比40:50:9.5:0.5 的二氯甲烷-乙腈-甲醇-0.01 mol∙L−1HCl混合溶液为展开剂，约15 min即可完成样品的测试。实验还尝试了铝基硅胶板、聚酰胺薄膜为固定相，样品展开时间大于30 min，因此未在此条件下进行后续条件试验。

表1 不同固定相和展开剂条件下的放射化学纯度测试结果Table 1 The radiochemical purity test results of different stationary phases and mobile phases

图1 氯化铜[64Cu]溶液供试品(a)及参比溶液(b)放射化学纯度谱图Fig.1 The radiochemical purity spectrum of copper[64Cu]chloride test solution(a)and reference solution(b)

2）展开剂组分比例优化：实验先通过固定展开剂中盐酸浓度，对展开剂中各组分的比例进行优化实验，测试了供试品和参比溶液，结果如表2 所示。由第4、5和6三个条件结果可见，展开剂中加入适量盐酸溶液调节酸度，对供试品形成具有良好峰型的单一主峰起到关键作用，其原因可能为通过提高展开剂酸度，抑制微量铜离子在近似中性展开条件下形成氢氧化铜胶体；当二氯甲烷比例过高或过低，对应乙腈比例过低或过高时，供试品存在轻微拖尾现象，导致放射化学纯度检测结果偏低，参比主峰峰型同样受到影响。因此选择第7号的条件为展开剂有机组分配比，即二氯甲烷、乙腈、甲醇体积比40:50:9.5。

表2 展开剂组成对放射化学纯度测试结果的影响Table 2 The effect of mobile phases composition on radiochemical purity

在确定流动相中有机相组成比例的基础上，又对盐酸溶液浓度进行了条件优化实验，结果见表3所 示。实 验 选 取0.01 mol ∙L−1、0.05 mol ∙L−1、0.1 mol∙L−1三个盐酸浓度进行供试品和参比溶液的测试。当盐酸浓度较高时，供试品可以获得较好的放射化学纯度测试结果，但参比主峰出现拖尾现象；当流动相中盐酸溶液浓度适当降低，供试品与参比溶液主峰均可获得较好的峰型，供试品溶液放射化学纯度可达98%以上，与图1中供试品谱图相比，点样端小峰明显变小，由此进一步证明供试品点样端小峰为氢氧化铜胶体峰；而铜离子与DTPA 在偏碱性条件下更易络合，因此展开剂酸度过高时参比主峰出现拖尾现象。综合以上因素，本实验选取0.05 mol∙L−1HCl溶液配制展开剂。

表3 展开剂中盐酸浓度对放射化学纯度测试结果的影响Table 3 The effect of hydrochloric acid concentration on radiochemical purity

3）参比溶液参数优化：本研究以两种浓度的DTPA 溶液与供试品按不同比例配制为参比溶液，进行参比溶液参数的优化，并以NaOH 溶液与供试品的混合溶液考察了酸碱条件对系统适用性的影响，结果见表4 所示。当NaOH 溶液与供试品体积比为1:1 时，测试结果仍为供试品主峰；NaOH 溶液相对过量时，混合溶液偏碱性，出现双峰，且有明显拖尾现象，为溶液中生成氢氧化铜沉淀，使点样端形成放射性谱峰。10 g∙L−1DTPA 溶液与供试品等体积或过量一倍混合为参比溶液时，形成峰型较好的单一或独立双峰；20 g∙L−1DTPA溶液与等量或过量供试品混合为参比溶液时，均可得到较好峰型的参比主峰，以上条件的参比溶液均可满足系统适用性要求。因此本研究中以常用的10 g∙L−1DTPA 溶液与等体积的供试品混合配制参比溶液。

表4 参比溶液参数优化Table 4 Parameter optimization of reference solution

通过上述条件筛选及优化实验，确定了氯化铜［64Cu］溶液放射化学纯度分析方法为：以iTLC-SG色谱纸为固定相，二氯甲烷、乙腈、甲醇、0.05 mol∙L−1HCl溶液按体积比40:50:9.5:0.5配制的混合溶液为流动相，以10 g∙L−1DTPA溶液与等体积的供试品混合配制为参比溶液。此条件下，氯化铜［64Cu］溶液供试品主峰的Rf值大于0.9，具有良好峰型；参比主峰Rf值小于0.1，供试品与参比主峰的分离度R大于1.0，满足系统适用性要求，完成分析方法的建立。

2.2 样品检验

用建立的分析方法对氯化铜［64Cu］溶液连续三批次的生产工艺验证样品进行检验，放射化学纯度为96.6%~99.3%，检验结果符合限度要求，证明本方法可用于产品的日常检验。

3 结语

本研究建立了一种快速、简便的氯化铜［64Cu］溶液放射化学纯度TLC分析方法。方法以iTLC-SG色谱纸为固定相，二氯甲烷、乙腈、甲醇、0.05 mol∙L−1HCl溶液按体积比40:50:9.5:0.5配制的混合溶液为流动相进行供试品和参比溶液分析。经多批次样品检验，证明方法适用于日常产品检验。参比溶液的放射性主峰与供试品主峰分离度大于1.0，满足系统适用性要求，达到欧洲药典中同类型医用放射性核素溶液检验方法的技术要求，为确保药物标记研究中对64Cu核素原料的质量控制提供了保证。

作者贡献声明王晓明为方法开发建立主要完成人；陈孟毅、吴福海、周佳骏参与具体条件优化实验；温凯、赵海龙提供氯化铜[64Cu]溶液样品；李洪玉为项目负责人，提供实验方案指导意见。