华蟾素对肝癌炎症微环境中HUVEC血管生成的调控作用

董星宇，朱 婷，李白坤，王 萌，朱继民，李庆林

(安徽中医药大学1.药学院，安徽 合肥 230012；2.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038；3.中医学院、4.生命科学学院，安徽 合肥 230012)

炎症微环境在肿瘤的发生、发展中发挥着重要促进作用[1-3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的重要成分。研究显示，低剂量LPS可增加炎症基因表达并促进小鼠肝细胞癌(hepatocellular cancer，HCC)的发展，而高水平LPS循环可促使慢性肝病患者发生HCC[4]。肿瘤血管新生可能是慢性炎症与肿瘤发展之间的重要桥梁[5-6]。白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)是重要的炎性细胞因子，其中IL-1β是血管生成开始的主要效应分子，能促使肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。VEGF与内皮细胞膜表面血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial cell growth factor receptor 2，VEGFR2)结合，协同促进血管生成[7]。炎症微环境和血管新生为肿瘤细胞增殖提供了有利条件，抗肿瘤血管生成是治疗恶性肿瘤的重要手段之一[8]。但抗血管生成药物不良反应较多、治疗效果不明显[9]。中药配合抗血管生成药物不但可以减轻药物带来的副作用，而且能降低肿瘤微血管密度[10]。华蟾素注射液(cinobufocini，CB)具有抗炎、抗肿瘤的功效[11]，推测其在发挥抗肝癌作用的同时，可通过改善肝癌炎症微环境，抑制血管新生，进而增强其抗癌作用。本研究采用细胞实验，初步探讨华蟾素注射液对肝癌炎症微环境中炎性因子表达水平，及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)增殖、迁移与血管生成的影响，从而为肿瘤的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器华蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批号181006-2)，LPS(北京兰杰柯科技有限公司，批号BS904)、CCK-8溶液(北京兰杰柯科技有限公司，批号69112500)、IL-1β酶联免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒(江苏酶免实业有限公司，批号MM-0179H2)、Matrigel(美国Corning公司，批号356234)、VEGF-C(美国CST公司，批号2)、VEGFR2(武汉三鹰生物技术有限公司，批号67407-1-1g)、SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit(山东思科捷生物技术有限公司，批号AUKLE)；倒置显微镜(日本Olympus公司)、细胞培养箱(德国Memmert公司)、酶标仪(美国MD公司)、电泳仪、电泳槽(美国Bio-Rad公司)、凝胶成像系统(广州博鹭腾生物技术有限公司)、实时PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人源肝癌细胞HepG2和HUVEC由中国科学院上海细胞库惠赠。用含有10%胎牛血清(美国Gibco，批号2254375CP)和1%青霉素-链霉素溶液(上海碧云天，批号040221210504)的DMEM培养基(普诺赛公司，批号PM150210)培养细胞。所有细胞株在37 ℃含5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2MTT法筛选CB最适给药浓度 将HepG2细胞接种于96孔培养板，每孔5 000个。待细胞贴壁后，随机设置对照组、给药组、空白组，每组设6个复孔。给药组设7个CB浓度：0.019、0.038、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 mg·L-1。药物处理后放入培养箱中，培养24 h后取出培养板，每孔加入10 μL MTT(5 g·L-1)溶液，继续于培养箱中孵育4 h，最后使用酶标仪于490 nm处检测每孔吸光度值。实验重复3次。

1.2.3MTT法筛选LPS最适作用浓度 将HepG2细胞接种于96孔培养板，每孔5 000个。待细胞贴壁后，随机设置对照组和LPS组，共设9个LPS浓度：2.5、5、10、20、40、80、160、320、640 mg·L-1。每组设6个复孔。药物作用24 h后使用酶标仪于490 nm处检测每孔吸光度值。具体方法同“1.2.2”。

1.2.4HepG2条件培养基(conditioned medium，CM)的制备 待培养瓶中HepG2细胞汇合度达到80%以上时，将完全培养基分别更换成无血清培养基、加LPS的无血清培养基、加LPS和CB的无血清培养基(LPS作用细胞24 h后加CB)。24 h后用无菌离心管收集培养基，800g离心10 min以去除细胞碎片和杂质，最后用无菌注射器吸取离心后的上清，并使用一次性针孔过滤器(0.22 μm)去除上清中可能含有的细菌。置于-80 ℃冰箱中保存。后文对应CM依次简写为H-CM、HL-CM、HLC-CM。使用前1 d转移至4 ℃冰箱。

1.2.5ELISA法检测IL-1β水平 按照试剂盒的操作说明书操作，使用酶标仪于450 nm波长处检测3种CM中IL-1β的吸光度，每组3个复孔，根据标准品线性回归曲线，按曲线方程计算不同的CM中IL-1β浓度值。

1.2.6CCK8法检测HUVEC增殖情况 将HUVEC细胞接种于96孔培养板，每孔6 000个。待细胞贴壁后，随机设置control(DMEM)、H-CM 、HL-CM、HLC-CM。每组4个复孔，每孔反应体积为100 μL。24 h后，取出培养板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱中继续孵育1 h。使用酶标仪于450 nm波长处检测每孔的吸光度值。

1.2.7HUVEC的体外迁移实验 将HUVEC细胞接种于6孔培养板，5×105个/孔。细胞汇合度达到80%以上后，弃去孔中培养基，磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗后使用黄枪头在孔的正中央倚靠直尺画一条笔直的线，再用PBS清洗划痕处去除残留的细胞碎片。随机分组。依次加入DMEM培养基、H-CM、HL-CM、HLC-CM。此时记为0 h，在显微镜下随机选取不同的视野拍照，24 h后再次拍照记录。

1.2.8HUVEC的体外成管实验 将HUVEC接种于6孔培养板，5×105个/孔。待细胞贴壁后，弃去原来培养基，更换为H-CM、HL-CM、HLC-CM，培养24 h后制成细胞悬液待用。在另一块96孔培养板中加入50 μL Matrigel，注意胶铺满孔底部并且无气泡，放入细胞培养箱等Matrigel凝固后取出培养板，将不同组的细胞悬液加入孔中，随后将培养板放入细胞培养箱中继续培养。3 h后在倒置显微镜下观察HUVEC成管情况并拍照。

1.2.9RT-qPCR法检测血管生成基因的mRNA表达水平 将HUVEC接种在75 cm2培养皿中，待细胞汇合程度达到70%～80%以上时，将完全培养基依次更换为无血清培养基、H-CM、HL-CM、HLC-CM。24 h后用TRIzol提取RNA，核酸蛋白定量仪检测RNA浓度，RNA反转录为cDNA，进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃ 2 min，1次；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，循环40次。2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。目的基因及内参基因(β-Actin)引物序列详见Tab 1。

Tab 1 Sequences of primer

1.2.10WB法检测血管生成蛋白表达水平 将HUVEC接种在75 cm2培养皿中，待细胞汇合程度达到70%～80%以上时，将完全培养基依次更换为无血清培养基、H-CM、HL-CM、HLC-CM。24 h后弃去皿中培养基加细胞裂解液静置15 min，收集皿中液体超声离心后取上清，BCA法测蛋白浓度。蛋白经凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭后，依次进行一抗、二抗孵育。最后使用超敏ECL底物化学发光检测试剂盒显色，自动凝胶成像系统曝光成像。采用ImageJ软件测定其灰度值，计算其相对表达量，以β-actin为内参。

2 结果

2.1 CB对HepG2增殖的影响CB处理24 h后，HepG2细胞活力降低且具有一定的剂量依赖特征。其中0.075、0.15、0.3 mg·L-1CB作用后细胞活力分别降至67.9%、57.8%、50.6%，0.3 mg·L-1的抑制率接近50%(Fig 1)。故本文将0.3 mg·L-1CB作用细胞24 h作为药物使用浓度和作用时间。

Fig 1 Effect of CB on proliferation of

2.2 LPS对HepG2活力的影响Fig 2结果显示，从2.5 到160 mg·L-17个浓度的LPS均使HepG2细胞活力明显增加(P<0.05)，而320、640 mg·L-1的LPS对HepG2活力的影响较小，但2.5 mg·L-1的LPS可使HepG2细胞存活率在24 h内达到最大(326%，Fig 2)。

Fig 2 Effect of LPS on viability of

2.3 CB对HepG2炎性因子表达水平的影响HL-CM组IL-1β表达水平最高，与H-CM组相比差异有统计学意义，而HLC-CM组IL-1β的浓度明显低于HL-CM组(Fig 3)。提示CB可抑制LPS诱导的肝细胞癌炎性因子分泌。

2.4 间接共培养对HUVEC增殖力的影响结果显示，H-CM和HL-CM可促进HUVEC增殖，而HLC-CM则抑制了HUVEC增殖。表现为HL-CM组细胞相对增殖率24 h内达到最大(约178%)，与H-CM组相比差异具有统计学意义；而HLC-CM组的相对增殖率(约95%)较HL-CM组明显降低(Fig 4)。

Fig 3 Concentration of IL-1β in conditioned

Fig 4 Effect of conditioned medium on HUVEC**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs H-CM group;△△P<0.01 vs HL-CM group.

2.5 间接共培养对HUVEC迁移力的影响结果显示，24 h内不同组HUVEC划痕面积变化不同。其中，HL-CM组24 h时HUVEC划痕面积最小，H-CM组的划痕面积多于HL-CM组；而HLC-CM组24 h内划痕面积变化不明显，其划痕面积明显多于HL-CM组，HLC-CM可能抑制了HUVEC迁移(Fig 5)。

2.6 间接共培养对HUVEC血管网络形成的影响结果显示，3 h后，H-CM、HL-CM组有明显的网状结构形成，其中HL-CM的网眼数目明显多于H-CM组(P<0.05)；Control组的网眼数目明显少于H-CM组；而HLC-CM组形成的网眼数目则较少，HLC-CM明显少于HL-CM组，差异具有统计学意义(Fig 6)。

2.7 间接共培养对HUVEC VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平的影响四组间两种mRNA的表达水平趋势相似，均为HL-CM组最高，其次为H-CM组，而HLC-CM和Control组则相对低，组间差异有统计学意义(Fig 7A)。

2.8 间接共培养对HUVEC VEGF、VEGFR2蛋白水平的影响与mRNA的表达水平相似，VEGF-C、VEGFR2在四组间的表达水平差异有统计学意义，表现为HL-CM组最多，H-CM组次之；而HLC-CM与Control组的表达水平则较低(Fig 7B)。

Fig 5 Effect of indirect co-cultivation on HUVEC

Fig 6 Effect of indirect co-culture on HUVEC

Fig 7 Effect of indirect co-culture on expression levels of HUVEC angiogenesis-related genes and

3 讨论

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，慢性炎症是其重要的病理特征[12]。抗肿瘤血管生成是肝癌治疗的重要手段之一，但是药物带来的副反应、患者易产生耐药性促使着治疗方案的改进[13]。CB是从中华大蟾蜍全皮中提取的一种天然活物质，具有良好的抗感染、抗炎、抗癌效果[14]。研究发现CB能够选择性作用于肿瘤细胞及恶性肿瘤血管，抑制其生长和增殖[15]，并能够抑制肺腺癌NF-κB通路，进而下调IL-6、IL-8等炎性因子水平发挥抗炎抗肿瘤的作用[16]。但CB对肝癌炎症微环境中血管生成的抑制作用和具体机制尚不明确。

肿瘤血管生成是肝癌的标志之一，此过程涉及到肝癌细胞与内皮细胞及肝癌微环境之间的相互作用[17]。在炎症微环境中，肝癌细胞自身会分泌大量的炎性因子，炎症因子诱导肿瘤细胞产生VEGF等血管生成因子，VEGF能够与内皮细胞表面的相关受体如VEGFR2结合，激活VEGF/VEGFR2信号通路，促进了内皮细胞增殖、转移、血管生成[18]。本研究使用ELISA试剂盒检测了三种肝癌细胞HepG2条件培养基中IL-1β的水平，发现LPS诱导后HepG2分泌更高水平的炎性因子，而CB能抑制炎性因子的水平。

接下来本研究基于HUVEC这一体外血管生成模型检测了其在正常培养、条件培养基培养下的增殖力、迁移力和成管力，并检测了HUVEC在不同干预下 VEGF-C、VEGFR2 mRNA和蛋白水平。结果显示，与正常培养组比较H-CM促进HUVEC增殖、迁移、网状结构的形成；HL-CM进一步提高了HUVEC的增殖力、迁移力和成管能力；而HLC-CM作用与前两组相反。提示LPS可能通过升高炎性因子水平，进而增强了HUVEC的增殖力、迁移力和成管能力，而CB能抑制LPS作用后HUVEC增殖力、迁移力、成管能力的增强。RT-qPCR和Western blot结果表明，与H-CM组相比HL-CM组HUVEC VEGF-C、VEGFR2 mRNA与蛋白水平均明显上升，而HLC-CM组的VEGF-C、VEGFR2 mRNA和蛋白水平则相应降低，本研究结果与胡叶等[15-16]相似。

可见，肝癌炎症微环境可能存在着细胞因子与HUVEC相互作用，从而促进了HUVEC增殖和血管生成，满足了肝癌细胞对营养、氧气等物质的需求，进而促进肝癌细胞发展，而炎症微环境在此过程中可能起着催化剂的作用；CB则降低炎性因子表达，改善肿瘤炎症微环境，从而抑制肿瘤血管生成，发挥抗癌作用。