聚合物整体柱微萃取/超高效液相色谱法测定蜂蜜中的4种磺胺类药物

2022-03-22成小丹范哲锋

分析测试学报 2022年3期

成小丹，范哲锋

（山西师范大学化学与材料科学学院，山西临汾 041004）

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是人工合成的抗生素，由于其抗菌谱较广、性质稳定、价格低廉和供应充足等优点，在医药工业和畜牧业中得到了广泛应用［1］。但在生产食物的动物中滥用这些药物可能造成毒性影响，SAs在食物链中累积会对人体产生不良反应，如抑制白细胞生成、损害泌尿系统和过敏反应等［2－3］。目前在许多动物来源的食物中发现了SAs残留物（如蜂蜜）［4－5］。由于食品中抗生素的种类多、浓度低，要检测其中的SAs残留仍需发展方便有效的富集分离技术。

目前色谱法是检测食品中SAs的常用技术［6－7］，由于样品的复杂性且SAs残留量低，有必要对样品进行适当的预处理。目前，已提出了液液萃取（LLE）［8］、单滴微萃取［9］、固相萃取（SPE）［10］、磁固相萃取（MSPE）［11］、搅拌棒吸附萃取（SBSE）［12］和固相微萃取（SPME）［13］等前处理方法。SPME以无溶剂萃取、样品消耗量少、微型便携、操作简单灵活等优点得到了广泛应用［14］。萃取介质是萃取过程中的关键因素，整体柱材料、磁性材料、分子印迹材料、共价有机骨架材料等新型材料已被用于SAs残留的前处理过程［15］。聚合物整体柱是由功能性单体、致孔剂、交联剂和引发剂的混合溶液在预烯基化的载体内部通过自由基引发原位聚合而成的连续床固定相，具有连续多孔、pH适用范围宽、萃取容量高和稳定性好等优点［16－18］。冯钰琦课题组在2006年提出了聚合物整体柱微萃取（PMME）的前处理方法［19］，该方法结合了SPME和整体柱的优势，具有良好的发展前景。

本文制备了聚（4-乙烯基苯甲酸-二乙烯基苯-4-乙烯基苯基硼酸）（poly（VBA-DVB-VPBA））整体柱，合成的整体柱官能团丰富，可通过离子交换、疏水作用、氢键和B－N配位等多种作用形式对磺胺类药物进行萃取富集。通过优化萃取条件，建立了poly（VBA-DVB-VPBA）整体柱微萃取/超高效液相色谱（PMME/UPLC）测定蜂蜜中磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺吡啶和磺胺噻唑的分析方法，为食品中SAs的提取分离提供了技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290超高效液相色谱仪（UPLC，美国Agilent公司）；Varian 660红外光谱仪（FT－IR，美国瓦里安公司）；JSM－7500F扫描电镜（SEM，日本电子株式会社）；HL－2S恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm i.d.，1.8μm，美国Agilent公司）；玻璃毛细管（1 000μm i.d.，南通医太科学仪器商店）。

磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、磺胺吡啶（SPD）、磺胺噻唑（STZ）购于源叶生物科技有限公司，用甲醇配制成1 mg/mL的储备液，于4℃冰箱保存；二乙烯基苯（DVB）、3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（硅烷偶联剂KH－570）、偶氮二异丁腈（AIBN）、甲醇（色谱纯）、4-乙烯基苯甲酸（VBA）和4-乙烯基苯硼酸（VPBA）购于阿拉丁试剂有限公司；甲苯（分析纯，洛阳市化学试剂厂）；丙酮（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；实验用水为超纯水（18.25 MΩ·cm，四川优普超纯科技有限公司），其它试剂均为分析纯。

1.2 Poly（VBA-DVB-VPBA）整体柱的制备及表征

Poly（VBA-DVB-VPBA）整体柱通过热引发自由基聚合法制备。将玻璃毛细管依次用1 mol/L NaOH溶液、HCl溶液浸泡12 h活化内壁后，用水和丙酮清洗；将活化后的毛细管中注满硅烷偶联剂KH－570的丙酮溶液（30%，体积分数），放置24 h进行硅烷化修饰，而后用丙酮冲洗并干燥；将40 mg VBA、20 mg VPBA、90μLDVB、250μL甲醇、100μL甲苯和10 mg AIBN混合，超声后将上述聚合液注入玻璃毛细管中，封闭两端在烘箱60℃下反应8 h。反应结束后将制备好的整体柱用甲醇冲洗除去未反应的原料，切割为5 cm备用。

将poly（VBA-DVB-VPBA）整体柱去除玻璃外壳，切割成表面平整的3～5 mm切片进行制样测试，通过扫描电镜（SEM）观察整体柱的微观形态，并结合能量色散光谱法（EDX）对材料的化学成分和元素含量进行检测；将整体柱研磨成粉末，在4 000～400 cm－1范围内采用傅里叶变换红外光谱仪（FT－IR）分析表面官能团。

1.3 分析方法

取适量SAs标准储备液，以水为溶剂配制0～200 ng/mL的系列混合标准溶液，使用poly（VBADVB-VPBA）整体柱进行萃取富集。萃取前用甲醇和水将整体柱冲洗活化，样品溶液用恒流泵上样，用甲醇洗脱目标物后进行分析。为提高整体柱对SAs药物的萃取性能，采用0.1μg/mL SAs的混合标准样品分别优化萃取条件，使用超高效液相色谱－二极管阵列检测器（UPLC－DAD）进行分离检测，通过色谱峰峰面积对萃取性能进行评价。

色谱条件：流动相为甲醇－水（20∶80，体积比）；流速为0.1 mL/min；柱温为30℃；DAD检测波长263 nm；自动进样器进样1μL；峰面积由数据分析处理软件积分获得。所有溶液在检测前均过0.22μm滤膜，流动相使用前需进行超声脱气。

2 结果与讨论

2.1 Poly（VBA-DVB-VPBA）整体柱的性能表征

采用SEM观察了整体柱的截面形貌（图1A），整体柱表面无明显裂缝，可用于后续实验操作；图1B显示合成的整体柱具有交联的骨架结构，内部连续多孔、结构均匀疏松，说明该柱通透性良好。用EDX观察其元素含量和分布状况（图1C），光谱中具有元素B、C、O的衍射峰，可以清楚地观察到各元素的能谱图。元素分析结果表明，该柱的硼、碳、氧含量分别为15.84%、71.91%和12.03%。在整体柱的FT－IR谱图中（图1D），3 445、2 923、1 698 cm－1处的吸收峰分别对应O—H、C—H和C=O键的伸缩振动吸收峰；1 603、1 508、1 487 cm－1处的吸收峰是苯基的特征谱带；1 416 cm－1处的吸收峰归属于B—O键。以上特征吸收峰证明成功合成了poly（VBA-DVB-VPBA）整体柱。

图1 Poly（VBA-DVB-VPBA）整体柱的扫描电镜图（A、B）、元素分布图（C）及傅里叶红外光谱图（D）Fig.1 SEMimages（A，B），EDX elemental mapping（C）and FT－IR spectrum（D）of the poly（VBA-DVB-VPBA）monolithic column

2.2 实验条件的优化

2.2.1pH值的优化磺胺类药物具有芳氨基和磺酰胺基，多为两性化合物，样品的酸碱度在吸附过程中会影响吸附剂的表面电荷以及分析物的存在形式，从而影响萃取效率［20］。考察了不同pH值（3、4、5、6、7、8）对萃取性能的影响，如图2A所示，4种SAs的峰面积随pH值从3增至4而增大，而后随pH值的升高逐渐减小。可能原因是pH值小于4时，SAs中的氮原子被质子化，只有π－π和疏水相互作用，有助于SAs的富集。随着样品pH值的增大，SAs中的氮原子逐渐发生去质子化过程，吸附剂中的羧基发生解离，因此增加了阳离子交换和B－N配位相互作用。随着氮原子的完全去质子化和吸附剂中硼酸基团的解离，吸附性能逐渐下降。因此选择最佳pH值为4。

2.2.2上样体积的优化在上样流速为0.5 mL/min时，考察了不同上样体积（1、2、3、4、5 mL）对萃取性能的影响。如图2B所示，4种SAs的峰面积随上样体积的增大而增加，当上样量为5 mL时色谱峰面积还在增加，说明未达到整体柱的饱和萃取容量。但样品量增大会使得萃取时间增加，因此选择最佳上样体积为3 mL。

2.2.3离子强度的优化SAs是极性化合物，因此盐度会影响其萃取性能［21］。通过加入不同质量浓度的NaCl（0、30、60、90、120 g/L）考察了离子强度对萃取性能的影响。如图2C所示，溶液中NaCl的质量浓度低于60 g/L时，盐析效应导致目标物在水溶液中的溶解度降低，促使目标物转移到萃取介质上，从而提高了萃取效果；当NaCl的质量浓度大于60 g/L后，盐浓度增加使得溶液的粘度增大，盐分子开始与目标物相互作用，极性分子可能参与溶液中盐离子的静电相互作用，进而降低目标物进入萃取介质的能力，不利于萃取。因此选择最佳离子强度为60 g/L NaCl。

2.2.4洗脱体积的优化以甲醇作为洗脱溶液，洗脱流速为0.3 mL/min，考察了不同洗脱体积（200、250、300、350、400、450μL）对萃取性能的影响。如图2D所示，200μL洗脱溶液可将目标物完全洗脱下来，随着洗脱溶液体积的增加，目标物被稀释，峰面积也随之降低。因此选择最佳洗脱体积为200μL。

图2 实验条件对poly（VBA-DVB-VPBA）整体柱微萃取0.1μg/mL SAs性能的影响（n=3）Fig.2 Effects of extraction conditions on poly（VBA-DVB-VPBA）monolith microextraction performance for 0.1μg/mL SAs（n=3）

2.3 分析性能

配制一系列质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/L的4种SAs混合标准溶液，在最佳实验条件下采用本方法进行测定，以各分析物的相对峰面积（y）对其质量浓度（x，mg/L）制作标准曲线（表1）。结果显示，磺胺嘧啶的线性范围为40～200 ng/mL，磺胺噻唑、磺胺吡啶和磺胺二甲基嘧啶的线性范围为60～200 ng/mL；相关系数（r2）均大于0.99。以萃取后分析物的校准曲线斜率与萃取前的斜率之比为富集因子（EF），得到该整体柱的富集因子为10.97～12.82。以聚合物整体柱萃取的SAs量占原样品溶液中SAs的比例为萃取率［22］，得到该整体柱的萃取率为73.1%～85.5%。

表1 Poly（VBA-DVB-VPBA）与UPLC联用测定4种SAs的分析性能参数Table 1 Analytical performances of the proposed method for the determination of four SAs

分别以线性范围下限浓度时萃取所得峰面积标准偏差的3倍和10倍除以校准曲线的斜率计算检出限（LOD）和定量下限（LOQ），4种SAs的LOD为8.32～16.2 ng/mL，LOQ为27.5～53.9 ng/mL。将该方法与文献报道的SAs检测方法进行对比（表2），结果表明本方法具有相对较宽的线性范围和较低的检出限，低于欧盟（EU）和中国农业部等规定的总磺胺类药物的最高残留水平（MRL）100 ng/g［23］，且本方法具有整体柱制备简单、成本低、稳定性好等优点。

表2 该方法与其它SAs分析方法的比较Table 2 Comparison of this work with reported methods for the determination of SAs

2.4 实际样品的测定

按照本方法对购于当地超市的蜂蜜样品进行分析，将样品用McIlvaine缓冲液（pH 4）处理，离心过滤后待萃取检测，并加入60.0、100 ng/mL的SAs混合标准溶液进行加标回收实验。由表3可见，蜂蜜样品中未检出4种SAs，其加标回收率为89.8%～105%，相对标准偏差（RSD，n=5）为2.0%～7.2%，表明该方法可行且有效。空白蜂蜜样品及加标样品的色谱图见图3。

图3 空白蜂蜜样品（a）、加标60.0 ng/mL样品（b）以及加标100 ng/mL样品（c）的色谱图Fig.3 Chromatograms of blank honey sample（a），spiked with 60.0 ng/mL sample（b）and spiked with 100 ng/mL sample（c）