“范尼”甲基磺酸乙酯诱变体系的建立和M4代干旱敏感突变体筛选

2022-03-21李玉环谢丽琼

种子 2022年2期

王玥，李玉环，李群，谢丽琼

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046； 2.奇台一中，新疆昌吉 831100)

亚麻(LinumusitatissimumL.)广泛栽种在中国西北西南等地，是我国重要经济作物之一，为一年生草本植物[1]。国内水肥充分的良田多用于主栽粮食作物，因而干旱凉冷之地是亚麻生产未来发展的主要方向[2]。干旱主要通过水分缺失损伤植物，阻碍其正常生长，水分对亚麻萌发和苗期尤为重要，因此这两个阶段对干旱胁迫极为敏感。干旱胁迫下，亚麻种子出苗不整齐，单位种植密度减少，产量下降[3]，生育期干旱还会影响亚麻纤维品质。室内常用PEG-6000作为渗透胁迫剂模拟水分胁迫，吴文荣[4]研究已为亚麻抗旱筛选体系的建立奠定了基础。与传统的杂交育种相比，诱变育种具有育种进程短、变异频率高、性状改良多等优点。甲基磺酸乙酯(EMS, ethyl methane sulfonate)常用于植株诱变进行性状改良，该试剂可改变DNA单个碱基，并具有较多且较为稳定的突变性状。目前已在玉米[5]、小麦[6]、水稻[7]等多种作物中对不同农艺性状进行了改良。Aghaee等[8]对萌发10 d后的亚麻幼苗分别施加6%、12%和18%的PEG-6000，水分亏缺显著增强了CAT、POD和SOD活性；闫文亮等[9]对15种亚麻种子进行PEG-6000胁迫处理，测定了发芽势，发芽率等7个指标，结果表明，亚麻种子相对吸水率可反应亚麻种子抗旱性强弱。谭义川等[10]采用20% PEG-6000对19份M4代EMS玉米诱变系模拟干旱胁迫，通过5个抗旱性指标筛选出4个抗旱性较好的诱变系；Khalil等[11]利用0.1% EMS诱变2个甘蔗品种，用28% PEG-6000筛选突变后代，通过多种生理参数和15对简单序列重复(SSR)获得ROC 22的抗旱突变株；Boarlaye等[12]利用EMS诱变亚麻，后代中外显子突变频率为每28 kb 1个，共得到13个纯合错义突变和2个纯合无义突变，并都被遗传至M3，M4代。可见利用EMS诱变加PEG筛选的突变体抗旱筛选体系已在多种作物中得到运用，但亚麻中还没有获得抗旱相关突变体的研究。本研究用EMS处理筛选已萌动纤用亚麻“范尼”种子的最适条件，通过M1代成株率建立种子最佳诱变体系，构建了“范尼”突变体库。PEG-6000模拟干旱胁迫对M4代突变体进行耐旱性评价，最终获得干旱敏感突变体。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为纤用亚麻“范尼”，经EMS诱变，2014年—2018年自交至M4代栽培于呼图壁以及米泉试验田。M4代突变体材料包括：M4-12-1，M4-5-5，M4-8-2，M4-32-4，M4-18-2，M4-6-2，M4-16-1。耐旱性筛选实验于2019年9月在新疆大学进行。

1.2 方法

1.2.1EMS处理亚麻种子“范尼”

挑选籽粒饱满无明显病状的种子，26 ℃温水浸泡种子过夜至胚根露白[13]。EMS溶液设置为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%等5个浓度，处理时间设置为4 h，8 h，12 h，16 h，共20个组合。EMS溶液浸泡亚麻种子，摇床120 r/min使种子与溶液充分接触；待浸泡完成后使用1%的硫代硫酸钠溶液浸泡种子0.5～1 h终止反应，使用流水冲洗至EMS无残留并立即播种，根据M1代半致死率确定EMS最佳诱变条件。统计M1代性状表型，确定变异性状，M2代单株留存种质，建立亚麻突变体库。

1.2.2M4代萌发期耐旱性评价

用15% PEG-6000处理大小一致、籽粒饱满的突变体种子，蒸馏水作为对照。75%的乙醇消毒3 min，蒸馏水清洗3遍自然风干后放入铺有2张无菌滤纸的培养皿(直径9 cm)中，每皿均匀分布30粒种子，分别加入10 mL溶液，24 ℃连续培养7 d，每2 d补加1 mL溶液，保持水势不变，设置3个重复。

1.2.3M4代苗期耐旱性评价

选取籽粒饱满突变体M4代种植于8 cm×8 cm育苗钵内，生长30 d后每个品种定苗30株，将1 L 18% PEG-6000浇灌到底部托盘模拟干旱环境，24 ℃连续处理7 d，每3 d复加1 L 18% PEG-6000，维持水势不变，设置3个重复。

1.2.4测量指标

按株系详细记录种质突变性状，成熟期单株收获突变体种质，无明显突变性状种质不保留。

EMS诱变成活率=成株数/处理的种子数[14]；

发芽率(%)=(7 d内正常发芽种子数/总种子数)×100%；

●whether it gets warmer or not. If the answer is "yes", that means it is time to sow highland barley.

相对发芽率(%)=(处理发芽率/对照发芽率)×100%；

相对芽长(%) =(处理芽长/对照芽长)×100%；

相对鲜重(%)=(处理鲜重/对照鲜重)×100%；

相对株高(%)=(处理株高/对照株高)×100%；

相对根长(%)=(处理根长/对照根长)×100%。

1.2.5抗旱性综合评价

式中Xi、Ximin、Ximax分别表示第i个指标测定值，第i个指标最大值和最小值。最后求和各性状隶属函数值：

1.3 数据处理

实测数据间的相关性分析，显著性检验采用Excel软件，SPSS(25.0)，R，软件完成；根长等测量通过Image J和Prism 5软件完成。

2 结果与分析

2.1 亚麻种子EMS诱变参数确定

选用5个不同浓度(0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)的EMS溶液和4个处理时间(4 h、8 h、12 h、16 h)，共20个组合处理已萌动的“范尼”种子。根据成株率和发芽率数值，对不同组合EMS处理的诱变结果进行研究。多重比较结果(表1)表明，随着处理浓度和时间增加，成株率均逐渐降低；处理时间和浓度组合与成株率之间具有显著差异；根据诱变半数致死率原则，亚麻EMS最佳诱变体系为EMS浓度0.6%、处理时间4 h和EMS浓度0.4%、处理8 h，在两个处理组合下亚麻种子发芽率为55%和56%。

表1 不同处理时间和浓度下成株率的多重比较

2.2 亚麻突变体库分析

2014年5月，采用EMS浓度0.6%，处理时间4 h，诱变5 000粒亚麻种子，露白播种。经EMS诱变处理M1“范尼”成株率为26.09%。在全生育时期记录M1代诱变性状，主要分为叶色、叶形、茎秆颜色、茎秆类型、株高、发育进程、白化等27种突变类型。为进一步分析EMS诱变特征，2015年5月，播种单株收获的269个具有表型变异的M1代，调查显示(图1)，269个突变株系中，共有55株稳定遗传，在M2代中发生表型突变率约为20.44%。根据EMS诱变成株率为26.09%，M1发生诱变率(5.38%)，M2代发生诱变率(1.1%)以及突变性状可遗传比率(20.44%)。

注：1为茎扁；2为顶端多分枝；3为叶枯萎；4为茎花斑；5为叶不展；6为白化；7为花序集中；8为叶黄；9为早熟。

表2 不同EMS浓度和处理时间下亚麻种子发芽率

2.3 7份M4代突变体抗旱性评价

EMS诱变株自交4代，获得7个与抗旱相关的突变体材料进行亚麻萌发期和苗期抗旱分析。

萌发期干旱胁迫结果表明，与野生型“范尼”相比，M4突变体各项生理指标均发生显著变化。其中M4-6-2在对照和处理条件下的萌发率为81%和75%，均显著低于其他突变材料(p<0.01)；M4-5-5的萌发率在对照和处理之间下降明显(p<0.01)(图2)；各材料间耐旱系数的隶属函数值相对发芽率最大，相对鲜重与相对芽长都较小；相对发芽率在种质间差异最小，相对鲜重在种质间差异最大(图3)；供试亚麻的D值变化范围为0.1～1，结果(图4)显示D值与相对鲜重，相对芽长呈极显著正相关关系。

注：小写英文字母显示0.01水平显著，C代表对照组(水处理)，D代表干旱处理(PEG-6000)。

图3 亚麻M4代突变体材料萌发期耐旱系数的隶属函数值

图4 萌发期耐旱系数的隶属函数值与D值的相关性分析

根据萌发期亚麻耐旱系数的隶属函数值，供试亚麻耐旱性分析如表3，抗旱隶属函数在0.04～1之间。M4-12-1与野生型范尼无差异，M4-18-2表现出较原种质相对耐旱，M4-6-2，M4-16-1在萌发期表现出对干旱极敏感性状。

表3 亚麻M4代突变体萌发期抗旱隶属函数值

苗期干旱胁迫结果显示，干旱处理后亚麻各生理指标均呈显著差异；其中相对鲜重变异系数最大，相对株高，相对根长都较小(图5)；相对鲜重，相对株高与D值呈显著相关性(图6)；D值变化范围在0.13～1之间，隶属函数分析显示：M4-8-2苗期较“范尼”耐旱，M4-6-2,M4-16-1表现为干旱敏感表型，其余种质为中等耐受(表4)。

表4 亚麻M4代突变体苗期抗旱隶属函数值

图5 亚麻M4代突变体苗期耐旱系数的隶属函数值

图6 苗期耐旱系数的隶属函数值与D值的相关性分析

2.4 抗旱性综合评价

根据隶属函数值对7份M4亚麻的抗旱性进行评价。萌发期亚麻抗旱品种等级排序：M4-18-2>M4-12-1>范尼>M4-5-5>M4-32-4>M4-8-2>M4-6-2>M4-16-1；苗期亚麻抗旱品种等级排序为：M4-8-2>“范尼”>M4-5-5>M4-32-4>M4-18-2>M4-12-1>M4-16-1>M4-6-2；萌发期，苗期耐旱筛选综合比较发现，与“范尼”相比，M4-8-2和M4-18-2分别在萌发期和苗期较为耐旱，但两品种在两个时期并未发现一致性；M4-12-1萌发期与“范尼”表现为相同耐受水平，苗期弱于“范尼”抗旱水平；M4-5-5，M4-8-2和M4-32-4抗旱性在萌发期和苗期均弱于范尼，M4-6-2,M4-16-1在萌发期和苗期均表现为干旱敏感性。

3 讨论

3.1 亚麻种质突变体库构建方法

由于EMS诱变方法简单，成功率高，已广泛运用于植株选育。目前已构建突变体库的植物包括拟南芥[15]、水稻[16]小麦[17]、大豆[18]、纤用亚麻[19]等，常见突变农艺性状包括高产[20]、早熟[21]、丰富叶型[22]、抗逆[23]等。

高浓度EMS处理诱变种质会损伤植株，造成处理后的种质发芽率降低、生长停滞或死亡，不同试验组合之间诱变差异显著，因此，最佳诱变条件选择尤为重要[24]。研究表明，EMS处理浓度和时间分别在0.025%～0.75%和4～18 h范围之间，不同处理方式之间差别极为显著[26-27]。EMS诱变育种选育评判标准为后代半致死率，根据实验室预实验结果确定EMS处理纤用亚麻“范尼”大田的处理浓度和处理时间组合为0.6%/4 h或0.4%/8 h。本实验田间共处理5 000粒亚麻种子，M1代具有突变性状的仅有269株，田间工作量大，成株率低，最终突变体数量少，这与徐艳花[14]，张凤方等[25]的研究结果一致。

3.2 突变体性状分析

EMS诱变为单碱基变化，性状丰富，但EMS诱变剂会对种子产生损伤，导致M1代部分植株生长受到影响。植物EMS诱变主要集中于茎、穗、产量和叶片等性状[28]。通过对亚麻不同生育时期变异性状统计发现M1代变异性状可遗传至后代[19]，因此M1代突变性状种类成为突变体库评价标准之一。本研究中，根据EMS诱变的M1代成株率为26.09%，M1代发生诱变概率为5.38%，M2代发生诱变率为1.1%，由M1代至M2代稳定遗传率约为20.44%。EMS性状可稳定遗传，桑贤春等[29]利用EMS诱变获得矮化水稻突变体dbc 1，基因鉴定性状受1对隐性基因调控，因此本实验获得的突变体也可进行进一步研究。

3.3 突变体对干旱胁迫的响应分析

水分是影响作物生长发育和产量的主要因素之一，通常种子萌发和苗期生长阶段对环境胁迫的响应最为迅速，因此，抗逆实验主要集中于萌发期和苗期[9]。亚麻在出苗25 d左右进入快速生长期，随后茎中韧皮纤维生长加厚，茎尖生长点分化为开花准备，这一阶段水分的利用对纤维品质和种子产量非常重要[30]。前人研究认为，亚麻抗旱性评价的指标中，发芽率[4]，芽长[31]，鲜重[30]权重贡献较大，加权隶属函数(D值)通过把各生理指标耐旱系数转化为[0，1]的度量值，可以综合评价不同品种的耐旱性[10]。本研究中，萌发期和苗期干旱处理相对鲜重变异系数均为最大值，说明相对鲜重与亚麻是否耐旱密切相关，相对鲜重与D值呈极显著正相关，在萌发期和苗期均保持一致趋势，这一结果与刘峰[32]等研究结果一致。

突变体材料M4-8-2和M4-18-2在萌发期和苗期对干旱胁迫的响应差异较大，表明萌发期干旱和苗期干旱，亚麻应对的机制可能并不相同，植物可能通过不同的策略完成对逆境的响应，这种现象在拟南芥耐盐实验中也有报道[33]。