房山紫堇种子形态与破除休眠研究

李 政， 林奕翰， 孙 哲， 张鑫瑞， 李澳旋， 乔永刚

(山西农业大学生命科学学院,中兽医药现代化山西省重点实验室， 山西 太谷 030801)

房山紫堇(CorydalisfangshanensisT. C. Tang ex S. Y. He)是罂粟科紫堇属植物[1]，产于北京房山、河北(正定、平山、内丘、邯郸、涉县)、河南(林县、辉县、修武)等地，一般生长于海拔500～1 600 m的石灰岩陡峭石壁上[2]。紫堇属植物通常生命力较为旺盛，对环境要求较低，具有防风固沙、水土保持的生态价值[3]。房山紫堇也作药用，以全草入药，具有清热解毒，治疗疥疮、发热等功效，有很高的药用价值与广阔的开发前景[8]。目前，房山紫堇仍为野生，在引种栽培相关研究与人工驯化开发方面未见报道。紫堇属植物的种子在自然条件下普遍存在休眠现象，发芽率低[9]，前期研究发现，房山紫堇也存在同样的问题，另外房山紫堇原生于岩壁，使得其引种驯化较为困难。房山紫堇野生资源现存量十分有限，2008年已被列为北京市二级保护野生植物物种[2]，急需通过引种驯化，在保护的基础上开发利用。

研究房山紫堇种子形态，寻找解除种子休眠，提高萌发率的方法，可以为驯化栽培与开发利用提供参考。本试验对房山紫堇种子形态结构进行分析，并探究自然条件下房山紫堇发芽最适温度，以及不同GA3浓度破除种子休眠的效果，以期找到解除房山紫堇种子休眠的方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

房山紫堇(CorydalisfangshanensisT. C. Tang ex S. Y. He)种子采集自山西省陵川县丈河村，由山西农业大学乔永刚副教授鉴定，标本种植于山西农业大学药用植物种质资源圃。选取生长良好的房山紫堇植株采集种子。室内考种，选取饱满无虫害的种子，并贮藏备用。

1.2 实验方法

1.2.1种子外部形态特征与吸水性

使用体视显微镜对房山紫堇种子的形态进行观察并描述，将种子浸泡于蒸馏水中，每隔2 h使用游标卡尺、天平等对种子的大小，千粒重等参数进行测量。观察种子形态时种脐朝上，露出种脐附属物。种子大小以长度、宽度、高度表示。使用百粒法测量种子千粒重，设5次重复试验，每次重复试验随机取种子100粒并称重，以5次重复试验的平均值计算千粒重。

1.2.2种子石蜡切片与形态学观察

选取饱满无虫害的房山紫堇种子，用FAA固定液(70%酒精∶冰乙酸∶甲醛=18∶1∶1，现配现用)固定，并将处理好的种子分别放入装有FAA固定液的2 mL离心管中，封口膜封盖，并用真空泵抽气下沉，待下沉后盖住离心管盖，放入4 ℃冰箱内冷藏过夜。使用轮转式切片机(YD-1508 R)做常规石蜡切片[10]。切片厚度为8 μm，切片方式为纵切。使用番红-甲苯胺蓝溶液染色，并用中性树胶封片，将切片结果置于Leica显微成像系统(型号DM 6 B)下进行观察，以全面了解房山紫堇种子内部结构。

1.2.3赤霉素浸种、培养温度对发芽的影响

采用纸上发芽法，除ck外，将50粒房山紫堇种子在相应处理下吸胀12 h，回干后均匀地平铺在有2层湿润滤纸的培养皿中，置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃的恒温培养箱(相对湿度为60%)，在黑暗条件下进行发芽试验。每隔12 h记录发芽种子数并更换滤纸。试验期间及时补充水分。

设浸种GA3浓度与发芽温度两个因素(表1)。GA3设置为5个浓度，即0、600 mg/L、1 200 mg/L、1 800 mg/L和2 400 mg/L。0为蒸馏水浸泡，每个处理3个重复，每个重复50粒种子。另设ck组，不进行12 h吸胀，不添加GA3溶液，其他与处理组相同。

表1 浸种浓度与发芽温度试验设计

逐日统计种子发芽个数，记录种子发芽状态，种子的发芽标准为：胚根突破种皮长度在1 mm以上，发芽时间为18 d，计算发芽率。

发芽率(%)=(发芽种子数/供试种子数)×100%

利用Excel 2019软件与SPSS 19.0统计软件进行数据处理并进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 房山紫堇种子的形态结构

由图1可见，房山紫堇种子呈扁圆形或椭球形，种皮坚硬，黑色且具有光泽，表面密布网点状凹痕。种脐位于种子背部近中央处，并附生有较大且坚硬的油质体，种子大小与重量较为稳定，大小为2.19 mm×1.56 mm×0.95 mm，种子千粒重为1.336 g，变异系数为0.035。

房山紫堇有坚硬致密的种皮，用清水浸泡对种子的吸水性进行研究。结果如图2所示，房山紫堇种子随着浸泡时间的延长，种子体积大小变化不明显，而种子的重量在浸泡2～4 h时出现明显升高，原因可能是致密的外壳并不妨碍种子的吸水性，又限于种皮的坚硬，使得种子的体积变化较不明显。

由图3可以看出，房山紫堇种子内部被营养细胞填充，呈灰白色或蜡白色，胚轴较小，长度约占种子长度的1/5，接近种脐。种脐处存在分泌细胞，并位于种皮外，向外分泌油状分泌物。

注：a为分泌细胞；b为分泌物；c为胚乳；d为种皮；e为种胚；f为种脐。

2.2 GA3浓度与发芽温度对房山紫堇种子发芽率的影响

对GA3浓度与发芽温度进行双因素五水平方差分析，ck组未纳入处理。其结果见表2。不同GA3浓度处理之间的差异不显著，不同GA3浓度与发芽温度的交互作用的差异显著，不同发芽温度处理间的差异极显著。

表2 GA3浓度与发芽温度进行双因素五水平方差分析结果

多重比较结果表明(表3)，除C1外，其他GA3浓度处理的发芽率均大于对照组(C6)的发芽率，最佳GA3浓度为C3、C4，平均发芽率为16%；最佳温度为T5，平均发芽率为18.89%。在0.05的水平下，C3和C1、C4和C1、C3和C6、C4和C6差异显著，其他GA3浓度之间差异不显著；T1与T5之间以及T3与T5之间差异显著，其他温度之间差异不显著。

表3 不同GA3浓度与温度对房山紫堇种子发芽率的影响

由图4与表4可看出，房山紫堇在C4T5(1 800 mg/L，30 ℃)处理时发芽率最高，可达28.3%。C3T2(1 200 mg/L，15 ℃)、C5T5(2 400 mg/L，30 ℃)与C6T4(ck，25 ℃)的发芽率次于C4T5，为26.7%，说明在较低温度下中等浓度的GA3可以显著提高发芽率，在高温时，高浓度GA3可显著提高种子发芽率。当使用清水发芽(C1)时，在T1(10 ℃)处理中，种子发芽率显著降低，说明在较低温度下房山紫堇种子发芽率降低。在C3(1 200 mg/L)系列处理中，温度为15 ℃时最适宜发芽，当温度为20 ℃和25 ℃时，发芽率降至较低水平，30 ℃时发芽率开始逐渐提高。在ck组(C6)中，当发芽温度逐渐升高至25 ℃时，发芽率最高，继续升高温度后发芽率呈下降趋势，说明房山紫堇自然条件下最适发芽温度为25 ℃。

表4 不同GA3浓度与温度条件组合之间平均发芽率

图4 不同 GA3浓度与温度下房山紫堇种子发芽率

3 讨 论

自然界中，限制种子萌发的因素有很多，其中种皮坚硬致密是限制因素之一，若将其种皮去除或使种皮产生空隙，则可以提高种子的萌发率[11]。紫堇属植物种子普遍存在表皮坚实，结构致密，透水性低等特点，使其存在休眠与发芽率低等问题[9]。本实验通过外部形态、石蜡切片观察和吸水性实验，发现房山紫堇与其他紫堇属植物形态相似，其种子存在坚实致密外壳，也存在附有油状分泌物的种脐。房山紫堇致密的外壳并不妨碍种子的吸水性，种脐具有自由吸水的特性，外壳坚硬可能是房山紫堇自然发芽率低的原因之一。

由于种子休眠在农业生产上有诸多不便，因此产生了许多破除种子休眠的方法[12]。GA3为激素处理中使用较为广泛的植物激素，其诱导产生水解酶，后者将种子中的大分子贮藏物质分解为小分子，并为胚所用，进而促进种子萌发，芦建国等[13]使用GA3结合低温沙藏层积提高刻叶紫堇种子萌发率。温度也是种子萌发的关键因素，不同物种的最适萌发温度不同。本实验使用不同浓度的GA3与温度梯度进行萌发实验，发现当温度处于30 ℃(T5)、GA3浓度为1 800 mg/L时发芽率最高，为28.3%。王娜等[14]研究了不同温度与GA3浓度处理对紫堇种子萌发的影响，本研究结果与之相似。而当温度为25 ℃(T4)，无GA3处理时，种子发芽率也较高，为26.7%，说明在无GA3处理下，在适宜的温度中也可达到较高的萌发率。但由于房山紫堇主要分布于太行山脉附近，其环境条件变化较大，无法常年保持适宜温度，使得自然条件下房山紫堇种子发芽率较低。在温度为15 ℃、25～30 ℃时，均有较高的发芽率组合。而温度为20 ℃时，不同GA3浓度处理效果较不明显，具体原因需要进一步研究。

房山紫堇具有极高的生态价值与药用价值，但由于自然条件下萌发率低使其常年供不应求。本实验研究了房山紫堇种子结构、激素与温度对种子萌发的影响，分析了自然萌发率低下的原因，找到了可提高种子萌发率的方式，为房山紫堇的生产、引种繁殖等方面提供理论基础。

综上所述，房山紫堇相对于其他紫堇属植物，自然发芽率低的原因主要是外壳坚硬和自然环境温度较低引起的。在种子引发时，发芽温度为30 ℃且GA3浓度为1 800 mg/L时可获得最高的发芽率。