贵州民族药石吊兰不同种质资源药材的品质评价研究

龙 毅， 刘 趣， 徐文芬， 孙庆文， 赵武霞， 王 波， 陈 亮

(贵州中医药大学， 贵阳 550025)

石吊兰为2020年版《中国药典》一部收载品种，也为2003年版《中药材、民族药材质量标准》收载的贵州少数民族常用药物，又名岩豇豆，来源于苦苣苔科吊石苣苔属植物吊石苣苔(LysionotuspauciflorusMaxim.)的干燥地上部分，具有止咳化痰、软坚散结、健脾消积之功效，常用于治疗咳嗽痰多、瘰疬痰核等疾病，民间常用来治疗慢性支气管炎、肺结核、风湿疼痛、跌打损伤等病症[1-2]。其原植物主要生长于喀斯特地貌地区的岩石上或树上，海拔300～2 000 m[3-4]。目前，市场上石吊兰药材主要依赖野生资源，随着临床需求越来越大，导致野生资源量逐渐减少，而石吊兰的人工栽培驯化尚缺乏系统科学的研究基础，严重影响了民族药资源的保护与可持续利用，加之各方面基础研究较薄弱，这将是制约贵州特色优势产业稳步健康发展的瓶颈问题。

种质资源对药材质量存在根本性的影响，是中药材规模化规范化基地建设的先决条件[5-8]。因此，开展对石吊兰野生种质资源品质评价，筛选其优良种源是该药材规范化种植研究的关键，本课题组开展了石吊兰药材引种驯化、野生抚育与品质评价等研究，发现连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、5,4′-二羟基-6,7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖苷(以下简称Ⅰ)及7-羟基-6,8,4′-三甲氧基-5-O-β-D-葡萄糖黄酮苷(以下简称Ⅱ)均对脂多糖(LPS)诱导的支气管上皮细胞BEAS-2 B体外支气管炎有较强的抑制作用，其中吊兰素是现行《中国药典》收载石吊兰质量控制指标。本文拟以石吊兰素、连翘脂苷B等上述5种有效成分为指标，采用超高效液相色谱法(UPLC)建立多指标成分含量测定方法[9-12]，分析评价产自不同地域的石吊兰种源药材质量，筛选出最优石吊兰种质资源。本研究将为科学地种植和可持续利用石吊兰药材提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1试药及供试样品

连翘脂苷B对照品(批号：111811-201603)、毛蕊花糖苷对照品(批号：111530-201512)、石吊兰素对照品(批号：111555-200602)均购于中国食品药品检定研究院；Ⅰ与Ⅱ均由实验室自制，经核磁共振、质谱等波谱技术结合文献鉴定结构，采用UPLC峰面积归一化法测定，其纯度均达98%以上，可供含量测定用，以下分别用Ⅰ、Ⅱ表示。乙腈、甲醇(美国天地有限公司，色谱级)；甲酸、甲醇、乙醇等、均为分析纯，实验用水为重蒸馏水。

供试药材样品(S 1～S 30)经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为苦苣苔科吊石苣苔属植物吊石苣苔(LysionotuspauciflorusMaxim.)的新鲜或干燥全草，净制后于40 ℃低温烘干、粉碎、过三号筛，备用。样品信息见表4。

1.1.2仪 器

Agilent 1290超高效液相色谱仪(DAD检测器，双二元梯度泵)；AG 135电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500 DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FN 101-2 A型电热恒温鼓风干燥箱(长沙仪器仪表厂)等。

1.2 方 法

1.2.1色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相为0.1%甲酸水-乙腈，梯度洗脱(洗脱程序见表1)；检测波长为332 nm；柱温25 ℃；进样量3 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.2.2溶液的制备

1) 对照品溶液的制备：分别取连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、Ⅰ及Ⅱ的对照品适量，精密称定，加80%甲醇溶液溶解制成质量浓度分别为5.006 mg/mL、2.500 mg/mL、0.400 0 mg/mL、0.160 0 mg/mL及1.004 mg/mL的单一对照品溶液，作为储备液。然后精密吸取各储备液0.5 mL并置于容量瓶中，加80%甲醇溶液制成每1 mL分别含连翘脂苷B为100.1 μg、毛蕊花糖苷为50.00 μg、石吊兰素为8.000 μg、Ⅰ为3.200 μg及Ⅱ为20.08 μg的混合对照品溶液，置4 ℃下冷藏，备用。

2) 供试品溶液的制备：取粉碎过三号筛的石吊兰药材粉末0.5 g，准确称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液15 mL，摇匀，密塞，称定其重量，超声处理20 min，取出，冷却至室温，以相应溶剂补足减失的重量，过滤，即得供试品溶液。

1.2.3专属性、线性关系、精密度、重复性、稳定性及加样回收率试验

1) 专属性试验。分别取上述混合对照品溶液、供试品溶液，以80%甲醇溶液为空白溶液，按优化确定的色谱条件进样检测，记录对照品溶液、供试品溶液及空白溶液的色谱图及待测成分色谱峰的紫外吸收光谱图。

2) 线性关系考察。取上述单一对照品溶液，分别制备成一系列梯度浓度对照品溶液，按照优化确定的色谱条件分别进样测定，记录色谱峰面积。以进样量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

3) 精密度试验。取上述混合对照品溶液，按优化确定的色谱条件连续进样测定6次，记录各待测成分峰面积，计算其峰面积的RSD值。

4) 重复性试验。取同一批药材粉末(S 29)6份，每份0.5 g，精密称定，按照供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按优化确定的色谱条件分别进样测定，将各待测成分峰面积分别代入标准曲线计算其含量，并计算其含量的RSD值。

5) 稳定性试验。取石吊兰药材粉末(S 29)0.5 g，精密称定，按1.2.2方法制备供试品溶液，在优化确定的色谱条件下分别于0、4、8、12、24、36 h进样测定，记录各待测成分峰面积，计算其峰面积的RSD值。

6) 加样回收试验。取已知含量的石吊兰药材粉末(S 29)0.25 g，精密称定，按1∶1的比例加入对照品，按照供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，按优化确定的色谱条件分别进样测定，将各待测成分峰面积分别代入标准曲线计算其含量，并计算回收率和RSD值。

1.2.4样品测定

分别取30批贵州不同种源石吊兰药材，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并按优化确定的色谱条件进样分析，分别记录各待测成分的峰面积，采用标准曲线法，计算干燥品石吊兰药材中连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、Ⅰ、Ⅱ的平均含量。

2 结果与分析

2.1 系统适用性、专属性、线性关系、精密度、重复性和稳定性试验结果

试验结果表明，系统适用性，连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、Ⅰ及Ⅱ 5种成分的色谱峰，色谱峰彼此之间及与杂质峰之间的分离度均≥1.5，峰形对称，且理论塔板数均不低于3 000。专属性如图1所示，供试品溶液中的待测成分色谱峰与对照品溶液中的连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、Ⅰ、Ⅱ及石吊兰素的保留时间和紫外吸收光谱图一致，且各色谱峰的纯度因子均>0.991，分离度均>1.5，达到基线分离；空白溶液在相应的保留时间处无色谱峰出现，说明空白溶液对待测成分无干扰，表明该方法专属性良好。线性关系，5种待测成分的回归方程、相关系数和线性范围见表2，结果表明，连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、Ⅰ及Ⅱ的进样量分别在0.004 806～15.02 μg，0.002 400～7.500 μg，0.001 920～1.200 μg，0.007 500～0.480 0 μg，0.000 963 8～3.012 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。精密度，连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、Ⅰ及Ⅱ对照品峰面积的RSD值分别为1.1%、1.8%、0.53%、1.9%、0.84%，均符合2020年版《中国药典》四部(通则0512)系统适应性试验要求，表明仪器精密度良好。重复性，6份供试品中连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、Ⅰ及Ⅱ的平均含量分别为1.5%、0.058%、0.34%、0.008 8%、0.13%，其RSD值分别为1.1%、1.3%、1.0%、2.5%、1.2%，均符合2020年版《中国药典》四部(通则9101)相关要求，表明此方法测定的重复性良好。稳定性，供试品中5种待测成分峰面积的RSD值分别为1.4%、2.3%、0.35%、1.0%、0.40%，均小于3.0%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

注：A为空白溶液；B为供试品溶液；C为对照品溶液；1为连翘酯苷B；2为毛蕊花糖苷；3为5,4′-二羟基-6,7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)；4为7-羟基-6,8,4′-三甲氧基-5-O-β-D-葡萄糖黄酮苷(Ⅱ)；5为石吊兰素。

表2 5种待测成分的回归方程、相关系数及线性范围结果

2.2 加样回收试验结果

连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、Ⅰ、Ⅱ的回收率分别为96.75%、104.68%、101.34%、100.88%、105.31%，其RSD值分别为2.5%、1.8%、3.5%、2.8%、2.0%，均符合2020年版《中国药典》四部(通则9101)相关要求，表明该方法测定结果的准确度良好，结果见表3。

表3 加样回收试验结果(n=6)

2.3 样品测定结果

30批石吊兰不同种源药材干燥样品中连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、Ⅰ、Ⅱ的含量，结果见表4和图2。

表4 30批石吊兰不同种源药材中5种有效成分含量测定结果(n=3)

图2 30批石吊兰不同种源药材中5种有效成分含量

3 讨 论

通过测定30批贵州石吊兰不同种质资源药材中连翘脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊兰素、5,4′-二羟基-6,7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)及7-羟基-6,8,4′-三甲氧基-5-O-β-D-葡萄糖黄酮苷(Ⅱ)的含量，不同种源药材中5种有效成分的含量差异均表现为连翘酯苷B>毛蕊花糖苷>Ⅱ>石吊兰素>Ⅰ。结果显示，以贵州惠水大龙乡、长顺代化镇、册亨戴家坡、安龙仙鹤坪产地的总含量较高。这一结果验证了不同的环境会引起同一药材原植物性状和代谢产物的差异。根据本研究结果，上述4个产地的石吊兰可作为最佳引种种质，建议可以通过引种观察及野生驯化研究，为民族药石吊兰的良种选育及规模化规范化种植研究提供前期基础。

本试验在前期石吊兰指纹图谱测定和文献基础上分别对流动相、色谱柱、波长、柱温等进行优化后确定色谱条件。同时为了最大限度地提取待测成分，提高检测的灵敏度，先后对提取方法、提取溶剂、提取时间、料液比进行考察，其中以提取溶剂和料液比的影响较大，提取方法、提取时间考察结果差异不明显，所以从提取操作方便和试剂成本角度出发，最终确定上述供试品溶液制备方法。

本研究在阐明石吊兰抗支气管炎药效物质的基础上，建立了石吊兰药材多有效成分指标含量测定方法，能够较全面地反映石吊兰药材的内在质量，为石吊兰不同种质资源药材质量的客观评价奠定了理论基础。同时，所建立的方法操作简便、准确、重复性好，为石吊兰药材质量标准提升及其相关制剂的质量控制和质量评价提供了参考。