血清胞苷尿苷鸟苷结合蛋白1在原发性肝癌中的表达及临床意义

王丽萍，侯佳影，周 君，于文清，刘清华

(1.石河子大学医学院，新疆 石河子 832000；2.新疆医科大学第一附属医院昌吉分院内分泌科，新疆 昌吉 831100；3.石河子大学医学院第一附属医院肿瘤内科，新疆 石河子 832008)

原发性肝癌(PHC)主要包括肝细胞癌、肝内胆管癌和两者混合型这三种不同病理学类型。病因分型有病毒相关性肝癌、酒精性肝癌、非酒精性脂肪肝病性肝癌及其他不明原因性肝癌；肝细胞癌(HCC)占PHC的75%～85%[1]。PHC是最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、发病率高、死亡率高、易转移、易复发及生存期短的特点，发病率及死亡率在全球分居第六和第三，在我国分居第四和第二，仅次于肺癌，严重威胁人民的生命健康[2]。肝癌早期症状不典型，发现时大多已是中晚期，手术机会仅20%～30%，且术后肿瘤复发与转移率高达40%～70%，因此，肝癌的早期诊断对治疗及预后具有十分重要的意义[3]。目前广泛运用于临床诊断的方法是血清甲胎蛋白(AFP)测定和彩超检查(US)。虽然血清AFP对PHC的诊断起着重要的作用，但在诊断中存在一定的假阴性。研究报道肝癌患者的AFP阳性率在60%～70%[4]，而且在胃癌、卵黄囊肿瘤等其他恶性肿瘤中也存在增高现象[5-6]，因此单一的诊断方式存在一定的局限性，故寻找新的高效的肿瘤标志物成为亟待解决的问题。血清胞苷尿苷鸟苷结合蛋白(CUGBP)1是RNA结合蛋白质CELF家族的一员，在细胞核中通过影响非连续外显子的保留或删除而调节mRNA前体的选择性剪接，在细胞质中，CUGBP1通过结合到靶向mRNA的特定序列而调节mRNA的翻译或降解，此外，CUGBP1还可通过RNA编辑酶而调节mRNA的编辑[7]。CUGBP1在机体基因转录与蛋白翻译过程中都有重要作用，CUGBP1失调会导致一系列的病理生理改变，CUGBP1在细胞转录、翻译以及代谢过程中起到重要作用[8]。近年研究表明CUGBP1与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，有研究显示CUGBP1在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中过表达，从而上调β-连环蛋白和波形蛋白水平，因此影响上皮细胞向间质转化[9-10]。CUGBP1在肝癌的发生、发展中也发挥重要作用。CUGBP1作为一种剪接因子，在肝癌中与胰岛素受体A的表达密切相关，胰岛素受体A可调节细胞的增殖，促进肝细胞肿瘤转化过程[11]。通过对人肝母细胞瘤样本做RNA-Seq分析发现CUGBP1的表达明显减低[12]。CUGBP1在肝癌的发生发展过程中有着特定的作用，其表达规律也可能为肝癌诊断提供新方法，然而，CUGBP1在血液中表达水平探究尚未见报道。本研究探讨CUGBP1在PHC中的表达水平及诊断价值。

1 资料与方法

1.1研究对象：收集2018年8月～2019年8月就诊于本院肿瘤内科、体检科、感染性疾病科和消化内科等相关科室体检健康者、慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化及PHC患者，共150例。其中男90例(60%)，女60例(40%)，年龄(55.2±7.99)岁。此研究已获得石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会批准且试验对象对本次研究知情同意并签署知情同意书。

1.2纳入标准及排除标准

1.2.1纳入标准：①有明确的慢性乙型病毒性肝炎感染史；②肝功能较好(Child-pugh分级A级或B级)；③依据《原发性肝癌诊疗规范》(2019年版)通过影像学检查或病理学检查诊断为原发性肝癌；④符合我国2019年《慢性乙型肝炎防治指南》或美国移植学会(AST)实践委员会发布2019年2月《病毒性肝炎指南》中肝硬化/慢性乙型肝炎诊断标准；⑤不伴有其他恶性肿瘤；⑥患者依从性好且自愿参加临床试验，有完整的病历资料。

1.2.2排除标准：①肝功能较差(Child-pugh分级为C级)或伴有大量腹水；②合并有其他类型肝炎或有急慢性炎性反应/泌尿系感染；③伴有其他恶性肿瘤； ④继发性肝癌；⑤研究者认为不适宜的其他情况或病历资料书写不完整，依从性差，不愿意参与临床研究。

1.3人口学基本情况：本研究共收集受检者150例，其中慢性乙型肝炎36例，男22例，女14例，年龄46～65岁，平均(52.42±6.09)岁；肝炎后肝硬化39例，男23例，女16例，年龄45～70岁，平均(55.41±7.85)岁；乙肝相关性PHC 43例，男27例，女16例，年龄41～71岁，平均(56.60±8.72)岁；对照组为32例健康体检者，男18例，女14例，年龄34～68岁，平均(56.19±8.57)岁。肝癌组与健康体检组、乙肝及肝硬化组间年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.4方法

1.4.1样本采集及处理：采集研究对象空腹外周静脉血5 ml置于肝素锂抗凝管中，室温血液自然凝固10～20 min，离心20 min(3 000 r/min)，收集上清液分装于EP管中，置于-80 ℃超低温冰箱保存；无RNA酶滴管取中间层白色部分于无酶EP管内，再用无RNA酶管加1 ml Trizol试剂，混匀后保存在-80℃超低温冰箱。

1.4.2酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清CUGBP1的表达情况：ELISA试剂盒购于江苏晶美生物科技有限公司，实验由1～2名实验员在同一条件，同一个实验室内严格按照试剂盒说明书进行操作。使用试剂盒中标准CUGBP1标准品，5倍比稀释测得的OD值建立标准曲线以计算患者血清标本中CUGBP1浓度。

1.4.3qRT-PCR检测PWBC中CUGBP1基因的表达情况：收集的外周血白细胞(PWBC)中加入500 μl Trizol试剂提取细胞总RNA。逆转录试剂盒购于Bimake公司，每10 μl的逆转录体系含总RNA 600 ng。qRT-PCR分析采用SYBR Green rRT-PCR试剂盒，引物序列CUBGP1(正义链：5'-GCCAACCTGTTCATCTACCACCTG-3'，反义链：5'-GGCAGACACGACATTCCCAAAGG-3')反应条件：95℃ 3 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环。β-actin(引物长度=144 bp，正义链：5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'，反义链：5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3')作为内参，定量RT-PCR数据使用2-ΔΔCT方法进行了分析。

2 结果

2.1各组血细胞计数与肝功能情况：体检健康组、乙型肝炎组、肝硬化组及肝癌组的血细胞计数中，与体检健康组比较，乙型肝炎组中性粒细胞百分比(N%)降低， 肝硬化组白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)均减少，肝癌组PLT减少，差异均具有统计意义(P<0.05)。与乙型肝炎组比较，肝硬化组与肝癌组PLT降低，N%增加，差异均具有统计意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组血细胞计数比较

肝功能检测中，与体检健康组比较，乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组白蛋白(ALB)明显减少，乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组谷丙转氨酶(ALT)的血清浓度明显增加，肝硬化组低于乙型肝炎组，差异有统计学意义(P<0.05)；血清谷草转氨酶(AST)与碱性磷酸酶(ALP)浓度在肝癌组明显高于其他组，差异有统计学意义(P<0.05)，乙型肝炎组、肝硬化组高于体检健康组，差异均具有统计意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组肝功能比较[M(Q1，Q3)]

2.2各组AFP、CUGBP1、癌胚抗原(CEA)、CA199水平比较：血清CUGBP1在乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组等肝病组中的表达水平低于体检健康组，差异均有统计学意义(P<0.001)，在乙型肝炎组、肝硬化组、肝癌组等肝病组之间表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；血清AFP在肝癌组的表达水平高于其他三组，差异均有统计学意义(P<0.001)，在乙型肝炎组、肝硬化组及体检健康组中表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；血清CA199在肝癌组、乙型肝炎组、肝硬化组中的表达水平高于体检健康组，肝癌组高于乙型肝炎组，差异均有统计学意义(P<0.05)，血清CA199在肝癌组表达水平高于乙型肝炎组和肝硬化组，差异均有统计学意义(P<0.05)；血清CEA在四组之间的表达无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组血清AFP、CUGBP1、CEA、CA199水平比较[M(Q1，Q3)]

2.3血清AFP、CUGBP1、CEA、CA199单项及联合检测对PHC临床诊断价值：以临床确诊为依据，考察各项血清学的单项与联合诊断的灵敏度与特异度。血清AFP对肝癌的诊断灵敏度与特异度分别为69.8%、87.9%，在血清CUGBP1的检测中，在约登指数为0.272时，测得敏感度和特异度分别为72.1%和60.7%，绘制ROC曲线，AUC=0.628 5。血清AFP、CEA、CA199、CUGBP1联合检测诊断敏感度95.3%，均高于各项指标单独检测的结果，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4～6，见图1。

表4 各组血清 AFP、CUGBP1、CEA、CA199单项及联合诊断阳性数比较[n(%)]

表5 AFP、CUGBP1、CEA、CA199对PHC诊断效能评价

2.4各组PWBC中CUGBP1基因表达水平：CUGBP1基因在肝癌组中的表达水平(0.67±0.29)低于体检健康组(1.00±0.25)，差异有统计学意义(P<0.05)，CUGBP1基因在乙型肝炎组(0.82±0.16)、肝硬化组(0.84±0.34)、体检健康组之间表达水平差异无统计学意义(P<0.05)。

2.5CUGBP1在AFP阴性PHC中的诊断价值：在PHC中，存在一部分患者AFP检测阴性，从而降低患者的临床检出率。在本研究肝癌组中有13例患者表现AFP阴性，通过检测AFP阴性患者CUGBP1的表达，并绘制ROC曲线，AUC=0.628 1，结果表明血清CUGBP1在AFP阴性患者中也有一定的诊断价值。见图2。

表6 血清AFP、CUGBP1、CEA、CA199在PHC中的ROC曲线情况

图1 血清AFP、CUGBP1、CEA、CA199用于诊断PHC的ROC曲线

图2 AFP阴性PHC患者中，血清CUGBP1用于诊断PHC的ROC曲线

3 讨论

PHC具有发生率高、转移率高、死亡率高和诊断率低等特点，手术治疗是早期肝癌的首要治疗方法，但由于其早期发病隐匿，大多数肝癌诊断时已经是中晚期，错过手术最佳时机[13]。因此，早发现、早诊断以及早治疗是提高肝癌患者生存率的关键。目前，临床用于肝癌早期诊断的血清标志物较少，临床公认的主要是AFP[14]。由于肝癌发生时肝细胞幼稚化明显增加，原本胚胎时期表达AFP再次出现表达增高，从而在血清学上能检测出肝癌特异性标志物，但AFP阳性率有限，容易出现漏诊[15]。因此，本研究试图寻找灵敏度高、检测简便的血清标志物，结合现有的检测手段，为肝癌的早期诊断提供新方法。

RNA结合蛋白CUGBP1此前已经研究报道参与调节肝脏的多个过程，包括出生后肝脏分化[16]，手术后肝脏增殖[17]以及损伤后肝脏恢复[18]。本研究发现，CUGBP1在肝癌的诊断中其敏感度高于目前临床运用中较多的分子标志物如AFP、CA199及CEA，结合多个分子标志物，通过联合检测的方式能明显增加肝癌的诊断灵敏度。在AFP阴性肝癌患者中，CUGBP1仍具有诊断价值，因此可为AFP阴性患者的诊断提供新的途径。众所周知，癌症的发生是通过改变转录、翻译和蛋白质修饰水平的基因表达来改变肝脏的生物学过程，因此，CUGBP1作为CCAAT增强子结合蛋白β和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)1翻译的关键调节剂，在肿瘤的发生、发展中有重要的调节作用[19-20]。有研究表明CUGBP1对肝癌的生长有一定的抑制作用，敲除CUGBP1基因的小鼠肝癌发生明显增加，预后更差,其抑制肿瘤的机制可能通过Ser302的去磷酸化从而激活CUGBP1的翻译活性[21]。本研究发现在肝癌患者中，血清CUGBP1的表达明显减低，PWBC中CUGBP1基因的表达水平也明显降低，与之前研究报道CUGBP1在小儿肝癌中明显降低基本相一致。在血清CUGBP1检测中，发现在乙型肝炎及肝硬化患者中也出现不同程度的减低，可能是由于肝疾病中肝细胞的功能与代谢的紊乱，从而对细胞基因转录产生一定的影响。肝损伤与肝癌发生发展过程中，癌性锚蛋白重复序列蛋白(Gank)能结合并触发CUGBP1去磷酸化，还能够导致CUGBP1在细胞质中被泛素化并随后降解，所以在肝病不同病例阶段时也会出现CUGBP1的减低[21]。

本研究通过CUBGP1及AFP等其他肿瘤标志物的联合诊断，结果表明联合诊断很大程度上提高了肝癌的诊断敏感度。但鉴于目前早期肝癌检测难度大、症状不明显、恶性程度高等特点，较高敏感度的检测手段具有一定的价值，可为患者起到提示作用，并能降低漏诊率，有助于肝癌早期诊断。本研究发现CUGBP1基因在肝癌患者PWBC中表达明显减低，乙型肝炎、肝硬化患者与健康体检组表达无明显差异。因此，综合分析血清学CUGBP1的表达水平与PWBC中CUGBP1的基因表达，对肝癌的早期诊断具有一定的现实意义。

综上所述，血清CUGBP1在肝癌患者中表达明显减低，在PWBC中CUGBP1基因表达也明显的减低，提示CUGBP1与肝脏疾病发生、发展存在一定的相关性。因此结合血清学检测与基因表达水平，表明CUGBP1可作为肝癌的潜在肿瘤标记物。同时结合AFP、CEA、CA199等肿瘤标志物的联合检测，可提高肝癌早期诊断敏感度，降低漏诊率，具有较好的辅助诊断价值。