园林废弃物高效降解菌的分离、筛选及鉴定

李 婷 蒋 朵 卢映菲 杨毅红

（电子科技大学中山学院，广东中山 528400）

园林废弃物包括落叶、枯枝等，是城市园林绿化过程中常见的生物质废物，其主要成分是纤维素。为提高园林废弃物利用效率，分离和筛选具有高效纤维素降解能力的降解菌株具有重要意义。目前，国内外关于纤维素降解的研究很多，包括单一高效菌株的筛选、鉴定及改造[1]，菌种的产酶性能、作用机理及应用效果[2-7]，复合菌株的研究等[8-9]。例如，张梦君等[1]从西藏高海拔的植物根际土壤中筛选具有高效降解纤维素能力的低温真菌，得到可在低温条件下生长且有较强降解能力的菌株；赵钰[2]从腐殖土中筛选出具有降解纤维素酶能力的放线菌，测定其酶活及其影响因素；孟建宇等[9]对酶活性高的菌株构建复合系，测定其滤纸降解能力，发现复合菌的降解能力是单菌株的5～10倍。因此，本研究的主要目的是筛选并获得高效园林废弃物降解菌株，并在此基础上与同类降解菌进行比较分析，可为进一步开展高效园林废弃物降解菌种制备提供基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样本。对园林废弃物堆积的腐殖土壤（0～20 cm土样）及腐烂的树叶进行取样，作为供试样本。

1.1.2 培养基与试剂。沙氏培养基配方为蛋白胨10g、葡萄糖40g、琼脂15.0g、氯霉素0.1g、蒸馏水1000mL；LB培养基配方为琼脂20g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 mL；CMC-Na培养基配方为CMC-Na15.0g、酵母粉 5.0 g、KH2PO41.0 g、琼脂 2.0 g、MgSO40.5g、NaCl5.0g、蛋白胨 10.0g、蒸馏水 1000mL，调节pH值至7.2；产酶培养基配方为CMC-Na15.0g、酵母粉 5.0 g、KH2PO42.0 g、蒸馏水 1 000 mL，调节pH值至7.0。培养基均为121℃灭菌25 min后使用。试剂包括二硝基水杨酸（DNS试剂）、刚果红染色剂等。试验所用试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器设备。试验仪器包括恒温振荡培养箱（上海智城分析仪器制造公司）、珠江牌培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）、立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、超净工作台（上海智城分析仪器制造公司）、高速冷冻离心机（铂金埃尔默企业管理上海有限公司）、酶标仪（铂金埃尔默企业管理上海有限公司）、旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 园林废弃物降解菌的分离与筛选。

（1）菌株分离。将采集的土样、腐烂落叶置于无菌水中，振荡均匀，稀释成一系列不同稀释度，取10-3、10-4、10-5、10-6稀释液 100 μL， 分别涂布于沙氏培养基和LB培养基，每个梯度重复2次。LB培养基置于37℃培养24 h，沙氏培养基置于28℃培养72 h。待长出菌落后，挑选单菌落接种于CMC-Na培养基上进行初步分离，CMC-Na培养基上分离得到纤维素降解菌株55株，将细菌编号为1～40号、真菌编号为41～55号。细菌、真菌分别于37℃和28℃培养48 h。

（2）菌株筛选。菌株初筛采用刚果红染色法，用1 mg/mL刚果红染液染色1 h，弃去染液，加入1 mol/L NaCl溶液脱色1 h。纤维素降解菌的位置会形成透明圈，选出具有水解圈的菌株共计15株。复筛采用产酶培养菌液，然后分别测定菌液内切型-β-葡聚糖酶活力（CMC酶活）、外切型-β-葡聚糖酶活。

（3）CMC酶活的测定。以1%羧甲基纤维素钠溶液作为底物，测试组选取1%羧甲基纤维素钠1 mL加入pH值=4.5的柠檬酸缓冲液0.5 mL、粗酶液0.5 mL，于50℃水浴锅中反应30 min。中止反应后，加入DNS试剂1.5 mL，将各管摇匀，沸水浴5 min，取出。待冷却至室温后，定容至20 mL，加塞，颠倒混匀，并测量其在540 nm下的OD值。空白组不进行50℃水浴，先加DNS以钝化酶活，其他操作都与测试组相同。以每分钟生成相当于1 μg的葡萄糖为1个酶活单位。

（4）外切型-β-葡聚糖酶活力的测定。在试管中加入1%微晶纤维素底物溶液和缓冲液0.5 mL，再加入酶液0.5 mL，于50℃水浴锅中反应30 min。中止反应后，与CMC酶的处理方式相同，在540 nm下测定其OD值。空白组不进行50℃水浴，先加DNS用于钝化酶活，其他操作都与对照组相同。以每分钟生成相当于1 μg的葡萄糖为1个酶活力单位。

1.2.2 纤维素降解菌鉴定。纤维素分解菌14、20、28、29、30、38号等菌株16S rDNA序列及系统发育分析。利用DNA提取试剂盒（Omega Soil DNA Kit）提取菌株基因组DNA，并以此DNA为模板，分别利用16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'）、1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）、ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行 PCR 扩增。PCR的反应体系为用量50 μL，DNA模板1 μL，10×Tagbuffer5.0μL，上、下游引物各 1μL，dNTP1μL，Taq酶1 μL，无菌去离子水 40 μL。 反应程序为94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延展1 min，72℃再次延展8 min，共30个循环。

取PCR产物5 μL在1.5%琼脂凝胶上进行电泳检测，然后送至赛默飞世尔公司进行测序。将得到的序列在NCBI中进行Blast比对，并在GenBank数据库中获取相似性较高的16S rDNA序列，然后利用MEGA 7.0版本软件进行聚类分析，构建系统发育树，进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选

2.1.1 初筛。从降解菌菌株的刚果红染色结果（表1）看出：水解圈直径较大的为52号和4号菌株，形成的水解圈直径分别达到36.00 mm和48.00 mm；水解圈与菌落大小（直径）比值较大的为20号、39号菌株，比值大小分别为7.00和6.00。对水解圈比值较大的10株菌株进行复筛。

表1 各样品菌落与水解圈比对

2.1.2 复筛。测定上述10株菌株（4号、14号、20号、28号、29号、30号、31号、38号、39号、51号）的粗酶液酶活，并进行复筛。CMC酶活和外切型-β-葡聚糖酶活测定结果见图1。由图1可知，这10株纤维素降解菌株中CMC酶活最大的为51号菌株（48.8 U/mL），其次为 4 号菌株（40.1 U/mL）、39 号菌株（38.2 U/mL）、31 号菌株（37.7U/mL）、14 号菌株（34.5U/mL）。 外切型-β-葡聚糖酶活最大的是51号菌株（6.6 U/mL），其次是 28 号菌株（6.2 U/mL）、4 号菌株（6.0 U/mL）、20号菌株（5.2 U/mL）。

2.2 菌株的鉴定

提取 4号、14号、20号、28号、29号、30号、31号、38号、39号、51号共10株菌株的总DNA，成功提取6株菌株的DNA。利用16S rDNA通用引物扩增后外送测序，最终成功获得4株菌株拼接序列，即14号、20号、29号和30号菌株。对各菌株及其相近序列进行建树，结果见图2。由图2可知，系统发育树的各节点自展值高于70，该系统发育树可信。14号菌、29号菌与假蕈状芽孢杆菌（ACMV01000212）聚为一支，且可信度达到100%，初步可断定14号、29号菌株为芽孢杆菌属（Bacillus spp.）。20号菌株与假单胞菌 （LT718459）、蒙特氏假单胞菌（NR 114224）聚为一支，可信度达到79%，可将20号菌株初步归为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。30号菌株与 3 株泛菌（NR 118857、KJ427829、MG450362）聚为一大支，与其中的泛菌（MG450362）聚为一小支，可信度达100%，30号菌株可初步判定为泛菌属（Pantoea sp.）。

3 结论与讨论

分离降解纤维素的微生物的方法众多，本文结合王洪媛等[10]、张梦君等[1]、王 伟等[11]及刘津[12]的研究，先分别在LB培养基、沙氏培养基上初步分离，随后进一步进行初筛、复筛，筛选分离出酶活性较高的6株菌株。在进行初筛时发现，水解圈直径越大，酶活不一定越大，且水解圈比值与酶活大小也并非成一次函数的关系，用刚果红染料染色CMC-Na、产生透明水解圈的方法作为判断菌株产纤维素酶能力的唯一凭证是不可靠的。这在蒋明星等[13]、候景昊等[14]的研究中也有类似情况出现。在复筛中发现，CMC酶活高的菌株，其外切型-β-葡聚糖酶活反而低。这是由于外切型-β-葡聚糖酶可以逐步地剪切还原性和非还原性末端纤维素链，释放可溶性纤维二糖或葡萄糖，CMC酶随机水解较容易进入的纤维素分子内水解β-1，4糖苷键产生新的链末端[15]，这2种酶相互作用可以形成有效的纤维素降解体系。

随后对14号、20号、29号和30号等4株菌株进行DNA测序。从创建菌株的系统发育树可以看出，4株菌株分属3个属，其中14号、29号菌株初步判定为芽孢杆菌属（Bacillus spp.），20号菌株初步归为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），30号菌株可初步归为为泛菌属（Pantoea sp.）。

王 伟等[11]在长期堆放秸秆牛粪处和玉米水稻秸秆处筛选出2株纤维素分解菌，将菌株发酵培养96 h后，其CMC酶活分别为26.9、22.9 U/mL；孟建宇等[16]从内蒙古大青山土壤中筛选出13株低温纤维素降解细菌，其CMC酶活为5.9～10.7 U/mL；路强强等[15]研究了13株常见纤维素降解菌，其CMC酶活为1.4～21.5 U/mL，外切型-β-葡聚糖酶活为1.9～14.3 U/mL；张家齐[17]在园林废弃物堆制栽培基质过程中分离出8株降解细菌，其CMC酶活为31.0～49.0 U/mL（表2）。本文所筛选到的6株降解菌株，其CMC酶活为22.0～34.5 U/mL，外切型-β-葡聚糖酶活为2.0～6.2 U/mL，处于中上水平。

表2 本研究与其他文献报道中CMC酶活和外切型-β-葡聚糖酶活