长期ART中HIV-1抗体存在的水平变化特点及其与HIV-1储存库相关关系的研究

张 晴，高 林，郭晓燕，孜来古丽·米吉提，郭云天，CHEN Wei-wei，焦艳梅，王福生

HIV-1是一种能攻击人体免疫系统的病毒，在没有接受任何治疗的情况下，对免疫系统中的CD4+T淋巴细胞进行大量破坏[1]。截至2020年底，全球有3770万人感染了HIV-1，其中150万人为新发感染者，约有68万人死于AIDS相关疾病[2]。随着抗反转录病毒治疗（antiretroviral therapy, ART）的推广，HIV-1感染者的病毒载量得到了有效控制，但由于HIV-1储存库的存在，ART停止后病毒载量会出现反弹[3]。因此，HIV-1储存库是AIDS功能性治愈的最大障碍，HIV-1储存库的定量检测对评估HIV-1储存库的大小至关重要。

目前检测HIV-1储存库大小的方法有定量病毒生长试验、Alu-gag PCR和tat/rev诱导的有限稀释法等[4]，但以上方法操作复杂且检测结果存在争议[5-6]。所以研究者试图探索出一种新的方法来检测HIV-1储存库大小。目前已有多项研究报道了HIV-1抗体水平与HIV-1储存库大小有关联[7-9]。HIV-1特异性抗体是由HIV-1刺激机体的免疫系统产生的一类免疫球蛋白，主要包括结构蛋白、调控蛋白和辅助蛋白[10]。以上HIV-1特异性抗体发挥作用不同，且不同抗体水平与HIV-1储存库大小的关系尚未明确。另有研究表明p24抗体水平与HIV-1感染者的临床状态有关，是较好的随访检测标志物[11]，关于p24抗体水平和HIV-1储存库大小的关系值得探讨。

目前评估HIV-1储存库大小最常用的指标是总HIV-1 DNA和细胞相关RNA（cell-associated RNA, CA-RNA）[12-13]，本研究纳入接受ART 5年的HIV-1感染者，检测患者的p24抗体、总HIV-1特异性抗体、总HIV-1 DNA和CA-RNA水平，探讨长期ART患者的p24抗体和总HIV-1特异性抗体水平及其与HIV-1储存库大小的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2009年11月—2013年7月于解放军总医院第五医学中心接受ART的147例HIV-1感染者作为研究对象。纳入标准：①HIV-1/AIDS诊断参照《中国艾滋病诊疗指南（2018版）》[14]中相关诊断标准；②经ART满5年；③ART6个月内患者HIV-1 RNA降至检测下限。排除标准：①临床信息不完整；②妊娠期妇女；③合并其他病毒感染（如HBV、HCV等）；④有HIV-1相关机会性感染；⑤死亡患者。排除不符合条件的感染者，最终有27例HIV-1感染者纳入本研究。本研究已通过我院伦理委员会批准，且所有入组患者均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 人外周血单个核细胞分离 用EDTA-K2真空采血管采集入组对象的静脉血2 ml、5 ml，其中2 ml管用于CD4+和CD8+T淋巴细胞计数的测定；5 ml管离心10 min后，上层血浆用于病毒载量的检测，余下的细胞采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）。

1.2.2 全血CD4+和CD8+T淋巴细胞计数 移取50 μl HIV-1感染者的EDTA抗凝全血置于绝对计数管中，加入20 μl CD3/CD4/CD8/CD45的组合抗体（美国BD公司），震荡混匀后于室温下避光孵育25 min，然后加入450 μl溶血素（美国BD公司），混匀后继续室温孵育20 min，孵育结束后使用FACS Calibur型流式细胞分析仪检测CD4+和CD8+T淋巴细胞的绝对数，并进行CD4/CD8比值的计算。

1.2.3 血浆HIV-1 RNA病毒载量检测 使用NPA-32P核酸纯化仪（杭州博日公司）先提取样本的RNA，然后使用HIV-1套式反转录荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒（杭州博日公司）在CFX96TM Real-Time system型荧光定量聚合酶链反应分析仪（美国BIO-RAD公司）上检测样本血浆中HIV-1 RNA，检测范围是80拷贝 /ml～ 1.8×108拷贝 /ml。

1.2.4 总HIV-1特异性抗体检测 根据HIV-1抗体诊断试剂盒（万泰生物，北京）说明书采用酶联免疫吸附试验对总HIV-1特异性抗体水平进行检测，在450 nm波长处，使用酶标仪读取不同孔的吸光度（OD）值，用OD值表示总HIV-1特异性抗体水平。

1.2.5 p24抗体定量检测 采用荧光素酶免疫吸附试验对p24抗体进行定量检测[15]：使用磷酸盐缓冲液（浓度0.01 mol/L，pH7.5）将G蛋白（Genscript，中国）稀释成5 μg/ml后，包被在96孔白色微孔板（Corning，美国）上，并在4 ℃下孵育12 h；然后用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗板后加入5%的脱脂牛奶，在37 ℃下封闭1 h；洗涤后每孔加入100 μl的血清样品（2%脱脂牛奶1∶100稀释），并于37℃下孵育1 h；再次洗涤后每孔加入50 μl荧光素p24抗原裂解上清液（2%脱脂牛奶1:1000稀释），并在37 ℃下孵育30 min。最后每孔加入50 μl的Nano-Glo荧光素酶检测试剂，并根据说明书读取荧光值（LU）。

1.2.6 总HIV-1 DNA和CA-RNA的定量检测 用QIAamp DNA Mini 试剂盒（Qiagen，德国）和HiPure Total RNA Plus Mini 试剂盒（Magen，中国广州）分别从PBMCs中提取细胞中总的DNA和RNA。用HIV-1 DNA定量检测试剂盒（SUPBIO，中国广州）和CA-RNA定量检测试剂盒（SUPBIO，中国广州）分别定量检测总HIV-1 DNA和CARNA。定量范围是10拷贝/106PBMC～5×106拷贝/106PBMC，检测结果以对数形式表示。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，GraphPad Prism 8.0软件进行绘图。计量资料根据需要采用±s或四分位数表示。各时间点与基线比较采用自身配对t检验。相关性分析采用Pearson相关性分析。P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 基本信息 27例患者中，男性26例，女性1例，HIV-1感染者开始接受ART时的年龄是（39.8±11.91）岁。接受3TC+NVP+AZT治疗的患者14例，接受3TC+AZT+EFV治疗的患者7例，接受3TC+EFV+TDF治疗的患者5例，接受3TC+NVP+TDF治疗的患者1例。详见表 1。

表1 27例患者基本信息Table 1 Basic information of 27 patients

2.2 长期ART过程中总HIV-1特异性抗体、p24抗体、总HIV-1 DNA和CA-RNA水平的变化 27例HIV-1感染者在ART 0、1、3、5年时p24抗体水平分别为2.450（1.910～5.460）、1.460（1.080～2.160）、1.280（1.120～ 1.800）、1.570（1.090～ 2.180）LU。随着ART时间的增加p24抗体水平呈逐渐降低的趋势，且在ART 1、3、5年时与基线进行比较，差异均有统计学意义（P 均＜0.05）（图1 A）。总HIV-1特异性抗体水平分别为3.378（3.157～3.710）、3.489（3.237～3.622）、3.446（2.742～ 3.573）、3.336（2.860～ 3.566）， 在ART期间没有发生显著变化（P 均＞ 0.05）（图1 B）。总HIV-1 DNA和CA-RNA水平在ART 0年时分别为3.580（3.200～3.750）和3.540（3.352～4.020）log10拷贝/106PBMC，ART 1年后水平均显著下降，分别为3.060（2.790～3.280）和2.790（2.510～3.310）log10拷贝/106PBMC，随后水平保持相对稳定，且在ART 1、3、5年时的总HIV-1 DNA和CA-RNA水平与基线分别进行比较，差异均有统计学意义（P均＜ 0.05）（图 1 C～D）。

图1 长期ART过程中p24抗体、总HIV-1特异性抗体、总HIV-1 DNA和CA-RNA水平的变化Figure 1 Changes in p24 antibodies, total HIV-1 specific antibodies, total HIV-1 DNA and CA-RNA levels during long-term ART

2.3 长期ART过程中p24抗体、总HIV-1特异性抗体水平和总HIV-1 DNA、CA-RNA水平相关性分析 结果显示，p24抗体水平与总HIV-1 DNA和CARNA水平均呈正相关（P 均＜ 0.05）（图2 A～B）。而总HIV-1特异性抗体水平与总HIV-1 DNA和CARNA水平均没有相关性（P 均＞ 0.05）（图2 C～D）。

图2 ART过程中p24抗体、总HIV-1特异性抗体水平和总HIV-1 DNA、CA-RNA水平的相关性Figure 2 Correlations between p24 antibodies and total HIV-1 specific antibodies levels and total HIV-1 DNA and CA-RNA levels during ART

3 讨 论

近年来，AIDS功能性治愈是全球研究的热点话题。所谓功能性治愈，是指中断ART后，AIDS患者血浆中的HIV-1 RNA持续低于检测下限，CD4+T细胞的数量和机体的免疫功能保持正常[16]。HIV-1储存库是目前AIDS功能性治愈的最大障碍，要想实现彻底清除HIV-1储存库这一目标，测量其大小显得尤为重要。目前有关HIV-1特异性抗体水平与HIV-1储存库大小关系的研究结果存在争议，限制了对AIDS功能性治愈的评估。本研究拟对不同HIV-1特异性抗体与HIV-1储存库之间的关系进行探讨，为AIDS功能性治愈的评估提供借鉴。

本研究发现在长期ART过程中，总HIV-1特异性抗体水平没有发生明显的变化，而p24抗体水平随着ART时间的增加呈逐渐降低的趋势。p24是HIV-1的衣壳蛋白，在HIV-1的复制过程中发挥重要作用。因此p24抗体是HIV-1诊断以及检测疾病进展的重要指标。关于ART导致p24抗体水平的降低，目前普遍观点认为是由于ART抑制了HIV-1的复制从而使抗原刺激缺乏导致的体液免疫缺陷[17-18]。另外，有研究发现HIV-1储存库建立的早晚也会影响ART期间HIV-1抗体的水平[19]。在急性HIV-1感染期间接受ART可能会限制HIV-1储存库的形成，并阻止HIV-1抗体反应。然而，在慢性HIV-1感染期间，HIV-1储存库已经建立起来，ART无法将其彻底清除，将会产生持续不断的抗原刺激。本研究中的HIV-1感染者在确诊感染至少1个月以上才开始接受ART，此时感染者体内有持续不断的抗原刺激机体维持一定的HIV-1抗体水平。这可能是本研究中总HIV-1特异性抗体水平在ART期间没有发生明显变化的原因。

本研究对长期ART过程中p24抗体、总HIV-1特异性抗体水平与HIV-1储存库大小之间的关系进行了探讨。结果发现，总HIV-1 DNA和CA-RNA水平在ART 1年后都显著下降，随后水平保持相对稳定，与p24抗体水平的变化趋势一致。经过相关性分析发现长期ART过程中总HIV-1 DNA和CA-RNA水平与p24抗体水平均呈正相关。以上结果表明，p24抗体水平与HIV-1储存库大小有关，p24抗体的水平可以区分储存库大小，与Burbelo等[11]研究结果一致。而夏阳等[20]的研究对52例HIV-1感染者的总HIV-1 DNA水平以及p24抗体水平进行相关性分析，结果发现总HIV-1 DNA水平与p24抗体水平之间没有相关性。以上结果不一致可能是患者差异所导致，包括治疗方案的差异、病毒亚群差异及随访时间点差异。另外，本研究发现总HIV-1特异性抗体水平与总HIV-1 DNA 和CA-RNA没有相关性，不能评估HIV-1储存库大小。而有研究对柏林病人干细胞移植前后的抗体水平进行蛋白质印迹法分析，结果显示移植后柏林病人中仍可检测到针对包膜蛋白的抗体，但针对核衣壳蛋白和聚合酶的抗体含量明显下降[21]。以上研究表明不同HIV-1特异性抗体与HIV-1储存库大小的关系不一致，为HIV-1特异性抗体水平和HIV-1储存库大小关系的研究提供了指导。

综上所述，总HIV-1特异性抗体水平随着ART时间的增加没有明显变化，且与总HIV-1 DNA和CA-RNA水平没有相关性；p24抗体水平随着ART 时间的增加呈逐渐下降趋势，且与总HIV-1 DNA以及CA-RNA水平均呈正相关关系。由此可见，患者体内p24抗体水平具有评估其HIV-1储存库大小的临床价值，值得进一步推广。但本研究存在一定的局限性，研究样本量较少，纵向观察时间较短（5年），该结论还须扩大样本量并延长随访年限加以进一步验证。