红豆杉多糖对D-半乳糖致衰老小鼠模型肝功能的影响

李露露 徐素美

衰老是机体细胞、组织的机能和结构出现的退行性变化，是生命发展的必然规律［1-2］，与高血压、2型糖尿病、动脉粥样硬化以及老年痴呆等许多疾病互为因果［3］。随着人口老龄化加剧，至2050年全球60岁以上的老年人口数将占据人口总数的22%［4］。D-半乳糖被广泛用于衰老模型的构建［5］，高剂量D-半乳糖氧化可产生过氧化氢和醛糖，可进一步形成自由基和超氧阴离子加速细胞凋亡［6-7］，使机体出现多种功能减退等现象。多糖抗衰老、调节免疫等作用的机制未完全阐明［8］。本研究旨在观察红豆杉多糖对D-半乳糖所造的衰老模型小鼠肝功能的影响，并初步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 90只雄性SPF级ICR小鼠，体质量（20±2）g，由南京大学模式实验动物研究所提供，实验动物生产许可证号：SYXK（苏）2015-0001。每笼4只分笼饲养，室温（24±2）℃，湿度50%～70%，光暗周期12 h/12 h，自由饮食饮水。

1.2 仪器及试剂 涡旋混合器（型号：WH-861，华利达实验设备有限公司），超声细胞粉碎机（型号：JYD-650，上海之信仪器），全自动生化仪（型号：AU480），低速离心机（型号：X12R，德国贝克曼公司），SpectraMax Plus384多功能酶标仪（美国MD公司），自动包埋机（型号：EC-350-1，德国MICROM有限公司），石蜡切片机（型号：HM 315，德国MICROM有限公司）。D-半乳糖（国药集团化学试剂有限公司），红豆杉多糖（红豆多糖含量：92.88%，分子量：59.2 Ku，单糖组成：甘露糖：葡萄糖：阿拉伯糖：半乳糖：鼠李糖=1∶1∶6∶4∶4，浙江省中医药研究院），多烯磷脂酰胆碱胶囊（易善复，赛诺菲制药有限公司），丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒（WST-1法）（南京建成生物工程研究所），总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（酶联免疫吸附法）（上海亿日科技有限公司）。

1.3 实验方法 （1）分组：ICR小鼠根据SPSS 21.0提供的随机数字分为6组，空白组、D-半乳糖模型组、阳性药物组（易善复）、红豆杉多糖低剂量组（200 mg·kg-1）、红豆杉多糖中剂量组（400 mg·kg-1）、红豆杉多糖高剂量组（800 mg·kg-1）组。（2）造模：除空白对照组，其余各组均给予颈部皮下注射D-半乳糖100 mg·kg-1，共8周。（3）干预：造模第4周起，空白对照组及D-半乳糖模型组分别给予NS 10 mL·kg-1灌胃，1次/天，连续4周；红豆杉多糖高/中/低剂量组分别给予由生理盐水配置的20 mg·mL-1、40 mg·mL-1、80 mg·mL-1红豆杉多糖水溶液灌胃10 mL·kg-1，1次/天，连续4周。（4）血清ALT、AST含量检测：造模第8周结束时，利用全自动生化仪检测小鼠血清AST、ALT水平。（5）肝组织匀浆中SOD活性、MDA含量、T-AOC测定：随机挑选10只小鼠，准确称取肝组织重量，按照肝组织重量（g）与NS体积（mL）为1∶9的比例加相应体积的NS，剪碎组织，冰水浴，肝组织匀浆经3,000 r/min离心10 min，取上清液，制备得到10%肝组织匀浆。利用酶联免疫吸附法检测小鼠肝组织匀浆总抗氧化能力（T-AOC）。比色法检测SOD活性及MDA含量。（6）小鼠肝脏HE染色：每组随机挑选5只小鼠，水合氯醛麻醉后，开胸暴露心脏，5%福尔马林灌注，取肝组织，放置4%多聚甲醛溶液中固定，按照浓度梯度进行脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，切片脱蜡至水，HE染色后观察肝组织变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干预8周后各组小鼠的一般情况 空白组小鼠皮肤较紧实，活动能力可；D-半乳糖模型组小鼠皮肤比较松弛，易激惹，活动度差；红豆杉多糖低/中/高剂量组和阳性药物组小鼠的精神状态可，皮肤松弛程度较模型组程度轻，活动度良好。

2.2 各组小鼠血清ALT、AST水平比较 与空白对照组比较，D-半乳糖模型组小鼠血清ALT、AST含量显著升高（P<0.01）。与D-半乳糖模型组比较，红豆杉多糖低/中/高剂量组及阳性药物组小鼠血清ALT、AST含量均显著降低（P<0.01）。肝功能改善程度与红豆杉多糖剂量无明显相关性。见表1。

表1 各组小鼠血清ALT、AST水平比较 ［n=15，（±s）］

表1 各组小鼠血清ALT、AST水平比较 ［n=15，（±s）］

注：与空白对照组比较，△P<0.01；与D-半乳糖模型组比较，*P<0.01

组别 ALT（U·L-1） AST（U·L-1）空白对照组 30.50±6.63 38.50±6.21 D-半乳糖模型组 41.00±16.67△ 81.57±17.18△阳性药物组 21.29±7.87* 53.86±21.64*红豆杉多糖低剂量组 20.29±4.15* 48.86±10.04*红豆杉多糖中剂量组 20.50±8.43* 48.43±10.89*红豆杉多糖高剂量组 19.88±8.17* 55.38±14.15*

2.3 各组小鼠肝脏组织匀浆SOD活性及MDA含量比较 与空白对照组比较，D-半乳糖模型组小鼠肝脏组织匀浆中SOD的活性降低、MDA含量升高（P<0.01）。与D-半乳糖模型组比较，红豆杉多糖低/中/高剂量组及阳性药物组小鼠肝组织匀浆中SOD活性均提高、MDA含量均降低（P<0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肝脏组织匀浆SOD活性及MDA含量比较［n=15，（±s）］

表2 各组小鼠肝脏组织匀浆SOD活性及MDA含量比较［n=15，（±s）］

注：与空白对照组比较，△P<0.01；与D-半乳糖模型组比较，#P<0.01，*P<0.05

组别 SOD活力（U·mgprot-1） MDA含量（nmol·mgprot-1）空白对照组 95.14±36.32 1.44±0.47 D-半乳糖模型组 61.01±17.52△ 2.15±0.41△阳性药物组 89.31±19.11* 1.44±0.53#红豆杉多糖低剂量组 96.73±40.66# 1.44±0.41#红豆杉多糖中剂量组 94.39±25.33# 1.48±0.48#红豆杉多糖高剂量组 87.70±29.42* 1.27±0.45#

2.4 各组小鼠肝组织匀浆的T-AOC比较 D-半乳糖模型组的T-AOC显著低于空白对照组（P<0.05），阳性药物组及红豆杉多糖低/中/高剂量组的T-AOC均高于D-半乳糖模型组（P<0.05）。见表3。

表3 各组小鼠肝组织匀浆的T-AOC比较［n=15，（±s）］

表3 各组小鼠肝组织匀浆的T-AOC比较［n=15，（±s）］

注：与空白对照组比较，△P<0.01；与D-半乳糖模型组比较，#P<0.01，*P<0.05

组别 T-AOC（U/mL）空白对照组 0.1715±0.0465 D-半乳糖模型组 0.1157±0.0278△阳性药物组 0.1720±0.0305#红豆杉多糖低剂量组 0.1750±0.0539*红豆杉多糖中剂量组 0.1745±0.0420*红豆杉多糖高剂量组 0.1773±0.0488*

2.5 各组小鼠肝组织病理组织变化 空白组小鼠镜下肝细胞排列整齐、紧密，小叶结构完整，细胞内未见明显脂肪变性，血管周围无明显炎症浸润；D-半乳糖模型组肝细胞排列稀疏，杂乱，细胞界线不清，细胞内可见大量的脂肪变性；红豆杉多糖低/中/高剂量组及阳性药物组小鼠的肝脏组织可见细胞排列尚整齐，肝小叶结构存在，血管周围无明显炎症浸润，肝细胞内脂肪变性程度轻。见图1。

图1 各组小鼠肝组织病理结果（HE×200）

3 讨论

机体的抗氧化防御与自身产生的自由基在正常生理条件下可维持相对平衡，机体在衰老过程中会产生大量自由基，当体内自由基失衡时，可引起衰老、疾病等。人体内的自由基主要是氧自由基，对不饱和共价键有特殊亲和力，能使脂质过氧化产生丙二醛进而破坏细胞膜的结构，使DNA分子解聚进而破坏细胞内线粒体导致细胞自溶。机体内还有许多抗氧化酶系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等［9-10］。自由基可破坏肝细胞膜、DNA及线粒体，从而引起肝细胞结构、蛋白合成异常以及能量失衡，从而诱发肝细胞坏死，激活库普弗细胞导致肝细胞纤维化［11-12］。研究表明，适量的D-半乳糖在代谢过程可通过转变为葡萄糖进而参与糖代谢过程，但过量D-半乳糖的摄入可生成大量的超氧阴离子和多种氧化产物，导致细胞氧化损害，进一步引起机体多脏器、多系统功能减退，最终引发衰老。D-半乳糖建模利用广泛，造模时间短，成模率较高，模型稳定［13-15］。

植物多糖具有广泛的药理学作用，在体内发挥的生物活性与其结构和被消化、酵解、吸收的过程有关，多是在经过消化酵解被吸收后进入细胞内发挥作用［16］。红豆杉为世界濒危珍稀植物，其树皮是著名抗癌物质紫杉醇的提取原材料。红豆杉属植物含有多种其他类型的化学成分，主要包括黄酮类、木脂素类、甾体类、酚酸类、倍半萜及多糖类化合物等［17］。红豆杉多糖是利用极性梯度提取技术在南方红豆杉枝叶中提纯发现的一种全新的多糖［18］，具有抗肿瘤、防治心肌梗死、抗糖尿病、抗氧化、调节免疫功能等作用［19-24］。本研究结果表明，红豆杉多糖可升高衰老模型小鼠肝组织均浆中的SOD活力、T-AOC，降低小鼠肝组织均浆中MDA含量，改善小鼠血清ALT、AST含量，提示其可能通过提高抗氧化损害从而发挥改善衰老模型小鼠肝功能的作用，并且无明显量效关系。基于此，本课题组将进一步建立体外模型来探讨红豆杉多糖保护衰老模型肝功能作用的具体靶点，为红豆杉多糖的药效评价提供数据支撑。