3株广西麻雀源H9N2亚型禽流感病毒对SPF鸡的致病性

2022-03-18谢芝勋罗思思谢丽基张民秀黄娇玲邓显文曾婷婷阮志华

南方农业学报 2022年11期

李孟，李丹，谢芝勋，罗思思，谢丽基，张民秀，黄娇玲，邓显文，曾婷婷，阮志华

（广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

0 引言

【研究意义】禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是一种具有囊膜的单股负链RNA病毒，其基因组由8个不同的独立片段组成，遗传不稳定且易发生基因重组和突变（Gu et al.，2017）。近年来，AIV不仅给养禽业造成巨大经济损失，还跨种传播引发越来越严重的公共卫生问题，已引起人们的广泛关注（王秀荣和陈化兰，2015）。野鸟被认为是AIV的天然储存宿主，从家禽体内分离获得的AIV均直接或间接来源于野鸟。因此，开展麻雀源H9N2亚型AIV对家禽的感染风险及致病性研究，对科学有效防控禽流感具有重要意义。【前人研究进展】依据病毒表面抗原的不同可将流感病毒划分为18个HA亚型和11个NA亚型，其中，H1～H16亚型可在野鸟和水禽中分离获得，而H17N10和H18N11只在南美的蝙蝠体内检测到（Tong et al.，2013；谭伟和谢芝勋，2015）。H9N2亚型AIV感染鸡群主要引起呼吸道、消化道和生殖系统疾病，进而造成鸡群生长缓慢及产蛋率下降等不良影响，是目前影响我国养禽业健康发展的主要亚型之一（顾敏等，2015；Li et al.，2017）。此外，H9N2亚型AIV直接感染人类的病例不断出现，对公共卫生安全已造成一定威胁（Sun et al.，2020）。H9N2亚型AIV于1966年首次分离于美国威斯康星州的火鸡群，我国于1994年在广东省首次报道（陈伯伦等，1994），随后在国内多个省份暴发流行。王冬冬等（2016）于2010—2014年从山东省发病鸡群中分离到1200多株H9N2亚型AIV，其中2013年的病毒分离率高达42.30%；丁园（2019）在2016—2018年从江苏及周边地区规模鸡场发病鸡群中分离获得50多株H9N2亚型AIV。可见，H9N2亚型AIV已给家禽养殖带来巨大的经济损失（顾敏等，2015；Zhu et al.，2018；Li et al.，2019；孙华鹏等，2021）。H9N2亚型AIV在自然界中的宿主范围十分广泛（Wang et al.，2016；Ma et al.，2019；Zhang et al.，2020），在野鸟中一般呈隐性感染，且可随其迁徙及停留在不同国家和地区间进行传播（蒋文明等，2017；Na et al.，2021）。刘晶（2019）对从不同湿地多种雁形目水鸟中分离获得的AIV进行遗传进化分析，结果发现分离株基因与不同迁徙路线上的病毒存在一定程度的基因交流；李玉磊（2020）对从我国主要野鸟栖息地分离到的AIV进行分析，发现其基因来源于北美等候鸟迁徙路线上的多个国家和地区。【本研究切入点】麻雀是一种常见的鸟类，在世界上许多国家广泛分布，通常成群出现在城市或乡村的林木上，有时也飞入鸡舍等动物饲养场所进行觅食（兰敏敏等，2018；贾碧云，2019）。麻雀可感染并携带AIV，且其群体和数量很大，活动范围十分广泛（Han et al.，2012；Broomandet al.，2019），广西处于候鸟迁徙路线上（Peng et al.，2013；Luo et al.，2017），加之特殊的开放式家禽饲养模式，给麻雀与家禽间创造了更多的接触机会，进而造成AIV在不同的禽鸟间进行传播。【拟解决的关键问题】明确麻雀源H9N2亚型AIV对鸡群的致病性，既有利于了解麻雀在H9N2亚型AIV传播生态链中的作用，对科学防控H9N2亚型AIV的暴发流行也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

毒株A/sparrow/Guangxi/92B7/2014（H9N2）、A/sparrow/Guangxi/130B2/2015（H9N2）、A/sparrow/Guangxi/160B8/2016（H9N2）分别简称为SP/GX/92B7/14、SP/GX/130B2/15和SP/GX/160B8/16，由广西兽医研究所分离鉴定并保存提供。SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，4周龄SPF鸡由广西兽医生物技术重点实验室自行孵化并在专用动物房SPF隔离器内饲养。MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、DL2000 DNA Marker、dNTPs和2×PCR Mix购自宝生物工程（北京）有限公司；小量胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；6'-Sialyllactose-PAA-biotin（6'SL-PAA）和3'-Sialyllactose-PAA-biotin（3'SL-PAA）购自GlycoTech公司；RNA抽提试剂盒、快速连接载体试剂盒和TMD底物溶液购自北京全式金生物技术股份有限公司；Streptavidin-HRP购自美国R&D Systems公司；其他试剂均为国产分析纯或标准产品。

1.2 麻雀源H9N2亚型AIV的HA基因遗传进化分析

根据RNA抽提试剂盒说明提取H9N2亚型AIV的RNA，并扩增其HA基因全长；HA基因PCR扩增产物纯化后，采用快速载体试剂盒进行连接和克隆转化，单克隆菌液经PCR鉴定，阳性菌液送至北京六合华大基因科技有限公司测序。测序结果拼接后以MEGA 7.0绘制分离毒株和参考毒株的HA基因系统发育进化树，同时分析其分子演化及遗传变异情况。

1.3 麻雀源H9N2亚型AIV受体亲和特性测定

根据已测定的病毒HA效价，每株分离毒株用包被缓冲液将其稀释至7 log2，稀释好的病毒液按每孔100 μL包被于96孔ELISA酶标板，样品板置于4 ℃冰箱包被过夜，同时每个样品均设空白对照孔。参照冉伟等（2013）的方法，将6'SL-PAA及3'SL-PAA唾液酸受体分别设3个不同的稀释梯度，每个稀释梯度均设3个重复，当加入终止液反应终止后，用酶标仪在450 nm波长下读取样品板中样品的吸光值。

1.4 鸡胚半数感染量（EID50）与鸡胚半数致死量（ELD50）测定

根据已测定的病毒HA效价，选取合适的5个稀释度，以PBS对H9亚型AIV分离株尿囊液进行10倍倍比稀释，然后接种至10日龄SPF鸡胚（0.2 mL/枚），每个稀释度接种5枚鸡胚。接种好的鸡胚置于35 ℃温箱继续孵育，观察并记录24～96 h内的死亡鸡胚数，同时收取24～96 h死胚和未死胚的尿囊液，通过HA试验检测各样品效价，然后按照Reed-Muench法分别计算不同毒株的ELD50和EID50。

1.5 麻雀源H9N2亚型AIV对SPF鸡的致病性试验

1.5.1 试验鸡分组及临床观察将84羽4周龄SPF鸡随机均分为4组，其中一组为空白对照组（21羽）；同时将3株不同麻雀源H9N2亚型AIV分离株尿囊液稀释至106EID50/100 μL，以100 μL稀释好的病毒液经鼻腔感染剩余3组的SPF鸡，每组感染16羽，并于病毒感染24 h后分别在各感染组放入剩余的5羽SPF鸡作为空白接触组，以评估H9N2亚型AIV在鸡群中的水平传播能力。

1.5.2 SPF鸡排毒及血清转阳检测于病毒感染后第1、3、5、7、9、11和13 d，分别采集感染组和空白对照组SPF鸡的咽喉和泄殖腔棉拭子进行病毒分离，以检测不同毒株感染SPF鸡后的排毒情况。在病毒感染后第14 d采集血样并分离血清，通过HI试验检测血清中的抗体水平，以评价SPF鸡血清转阳情况。病毒感染后连续观察并记录各处理组SPF鸡的临床症状。

1.5.3 SPF鸡剖检及显微病变观察病毒感染3 d后，各处理组随机选取3羽SPF鸡进行剖杀，观察其病变并分别采集肾脏、胰腺、脑、肝脏、脾脏、心脏、气管、胸腺、法氏囊、盲肠扁桃体和肺脏等器官组织，固定后送至广西中医药大学病理教研室制作病理切片。

1.5.4 病毒在SPF鸡不同脏器复制情况检测病毒感染3 d后，各处理组随机选取3羽SPF鸡进行剖检，分别采集肾脏、胰腺、脑、肝脏、脾脏、心脏、气管、胸腺、法氏囊、盲肠扁桃体和肺脏等器官组织，经研磨处理及冻融3次后，接种鸡胚进行病毒含量滴定，根据病毒滴定结果判定其在鸡不同脏器内的复制情况。

2 结果与分析

2.1 3株麻雀源H9N2亚型AIV的HA基因遗传进化分析结果

根据构建的HA基因系统发育进化树（图1）可知，毒株SP/GX/130B2/15与大多数从家禽中分离获得的毒株在遗传进化关系上同属于Y280/G9大分支，但与常见参考毒株（包括疫苗株SS/SD96/JY）分别归属于不同的进化小分支；毒株SP/GX/92B7/14和SP/GX/160B8/16在遗传进化关系上属于以A/quail/Hong Kong/G1/97为代表的G1大分支，与现有疫苗株（SS/SD696/JY）的遗传进化关系较远。3株麻雀源H9N2亚型AIV在HA蛋白裂解位点处不存在多个碱性氨基酸插入现象，表现为RSSR↓GLF，符合低致病性AIV（LP-AIV）的典型分子特征。毒株SP/GX/92B7/14和SP/GX/160B8/16的HA蛋白氨基酸序列第234位与第236位氨基酸分别为Gln（Q）和Gly（G），仅具有SAα2,3的受体亲和特性；毒株SP/GX/130B2/15在上述2个位点均为Leu（L）和Gly（G），具有SAα2,3和SAα2,6的2种受体亲和特性。

图1 3株麻雀源H9N2亚型AIV的HA基因系统发育进化树Fig.1 Phylogenic tree for HA gene of three H9N2 subtype AIVs from sparrow

2.2 3株麻雀源H9N2亚型AIV受体亲和性测定结果

运用ELISA对纯化的3株麻雀源H9N2亚型AIV进行受体结合特异性测定，结果表明，毒株SP/GX/92B7/14和SP/GX/160B8/16只具有与SAα2,3受体结合的特性，而毒株SP/GX/130B2/15除了优先选择与SAα2,3受体结合外，还具有与SAα2,6受体结合的特性。

2.3 3株麻雀源H9N2亚型AIV的鸡胚ELD50和EID50

根据Reed-Muench法计算3株麻雀源H9N2亚型AIV的鸡胚ELD50和EID50，结果（表1）显示，3株麻雀源H9N2亚型AIV的EID50在10-6.0/0.2 mL～10-6.8/0.2 mL，ELD50在10-6.8/0.2 mL～10-7.2/0.2 mL。

表1 3株麻雀源H9N2亚型AIV对10日龄SPF鸡胚的ELD50和EID50Table 1 ELD50 and EID50 of three H9N2 subtype AIVs from sparrow to 10-day SPF chicken embryos

2.4 3株麻雀源H9N2亚型AIV对SPF鸡的致病性

2.4.1 3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的临床症状与空白对照组相比，3个感染组的SPF鸡在感染病毒后21 d内均出现精神沉郁和轻微的呼吸道症状，但未出现鸡只死亡现象，其结果符合世界动物卫生组织（OIE）关于LP-AIV的临床判定标准，与HA基因裂解位点的分析结果一致。

2.4.2 3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的排毒及血清转阳情况 3株H9N2亚型AIV稀释至106EID50/100 μL对SPF鸡进行滴鼻感染，在病毒感染后第1、3、5、7、9、11和13 d进行咽喉和泄殖腔棉拭子采集，再对鸡胚增殖后有HA效价的样品进行统计分析，结果发现各毒株感染SPF鸡后的排毒能力存在一定差异（表2）。在3个感染组中，仅毒株SP/GX/92B7/14在感染后的鸡泄殖腔棉拭子中未检测到，咽喉棉拭子也只在感染后第3、5和7 d的少数鸡只中检测到对应的病毒，说明毒株SP/GX/92B7/14感染鸡后可能只进行呼吸道排毒且排毒能力不强；毒株SP/GX/130B2/15和SP/GX/160B8/16均能通过咽喉及泄殖腔排毒，且感染第3 d主要通过呼吸道向外排毒，第5和7 d则主要通过消化道向外排毒。病毒检测结果还发现，3个感染组的鸡只均在病毒感染后第7 d基本停止向外排毒，即3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的排毒期主要介于第1～7 d。

表2 3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的排毒及血清转阳情况Table 2 Detection of detoxification and seroconversion in chickens infected with three H9N2 subtype AIVs from sparrow

病毒感染后第14 d的鸡血清抗体水平检测结果表明，3株麻雀源H9N2亚型AIV不仅能使感染的鸡只产生较强抗体，还能使空白接触组的鸡只（除感染SP/GX/130B2/15的鸡群仅感染空白接触组的3/5外，其余试验组均感染了空白接触组的全部鸡群）产生对应抗体，说明3株麻雀源H9N2亚型AIV不经体内环境适应也可直接感染鸡群，且能传播感染同居的空白鸡群，即具备在鸡群间水平传播的能力。可见，麻雀源SP/GX/92B7/14、SP/GX/130B2/15和SP/GX/160B8/16均能不经体内适应而直接感染鸡群并排毒。

2.4.3 3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的剖检病变及组织病理切片观察结果在感染病毒后第3 d对感染组和空白对照组的鸡只进行解剖，结果发现3个感染组约有2/3的鸡分别在气管和肺脏出现不同程度的充血或出血病变（图2），但其他脏器均未发现明显的病变。组织病理切片观察发现：与空白对照组（图3-A和图3-C）相比，3个感染组鸡群的脑组织均未出现任何病理损伤，气管黏膜上皮部分纤毛出现脱落，黏膜下层毛细血管扩张充血且伴随有部分淋巴细胞浸润（图3-B）；肺脏中的肺泡壁增厚且有较多红细胞渗透到肺泡中，肺间质中有少量淋巴细胞浸润（图3-D）；心脏也未发现任何病变和组织损伤；肝脏出现少量的灶状和点状坏死；脾脏呈现红、白髓比例增高，红髓髓窦扩张充血；肾脏组织仅表现为毒株SP/GX/92B7/14感染后肾间质血管扩张充血，有淋巴细胞浸润；胸腺、法氏囊及其他组织器官均未出现任何病理变化或组织损伤。说明3株麻雀源H9N2亚型AIV对鸡上呼吸道的气管及肺脏损伤较严重。

图2 麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后气管和肺脏的病理变化Fig.2 Trachea and lung lesions of SPF chickens infected with H9N2 subtype AIV from sparrow

图3 麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后气管和肺脏的组织病理切片观察结果Fig.3 Histopathologic section observation of trachea and lung of SPF chickens infected with H9N2 subtype AIV from sparrow

2.4.4 3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后不同组织中的病毒复制情况在滴鼻感染H9N2亚型AIV后第3 d从各感染组鸡群中随机选取3羽进行剖检，分别采集呼吸系统的气管和肺脏，免疫系统的胸腺、脾脏、盲肠扁桃体和法氏囊，以及脑、心脏、胰腺和肾脏等器官组织，经研磨处理后接种鸡胚进行病毒含量滴定。结果（表3）显示，3株麻雀源H9N2亚型AIV在SPF鸡体内各器官中的复制能力存在一定差异，可在感染鸡只的气管和肺脏中进行有效复制，而在肝脏、脑、胰腺、胸腺、心脏、盲肠扁桃体及法氏囊中均未检测到对应的病毒。毒株SP/GX/92B7/14感染的个别鸡只其肾脏和脾脏中可检测到对应病毒。

表3 3株麻雀源H9N2亚型AIV在感染鸡只各器官组织中的复制情况Table 3 The virus titer of three H9N2 subtype AIVs from sparrow in organs of infected chickens

3 讨论

野鸟是H9N2亚型AIV的天然储存库，其宿主范围还在不断扩大（张静等，2016；杨勇等，2020），可随野鸟的迁徙而长距离传播。AIV监测结果表明，广西地区的野鸟携带有大量H9N2亚型AIV（黄胜斌等，2011；徐倩，2015；李云燕，2020），加之广西家禽的养殖模式以散养为主，交易方式以活禽市场交易为主，为野鸟与家禽在野外及活禽市场接触或混居提供了机会，同时为AIV的传播和变异创造了有利条件（熊文婕等，2018）。疫苗接种仍是当前防控禽流感暴发流行的最有效手段，野鸟带毒迁徙造成的病毒传播和疫苗免疫压力导致的AIV抗原变异，均给H9亚型禽流感防控带来极大挑战（刘兆洁，2017；屈孟锦，2019）。前期的AIV广西分离株遗传进化分析结果表明，从野鸟和家禽中分离获得的H9N2亚型AIV归属于Y280/G9和G1两大分支，与目前常用的疫苗株亲缘关系较远（李丹，2017）。本研究选取3株HA基因分别来源于Y280/G9-Like和G1-Like谱系的麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡，结果表明，3株麻雀源H9N2亚型AIV可直接感染SPF鸡，鸡群感染后表现出精神沉郁和轻微的呼吸道症状，排毒检测结果证实3株病毒感染鸡后可通过呼吸道等途径向外

排毒，也可水平传播给同群空白鸡。国内已有研究表明，野鸟源（鹌鹑和燕雀等）H9N2亚型AIV均对SPF鸡有感染性，且大部分毒株具有在鸡群中水平传播的能力（于扬等，2016；蒋文明等，2017；袁静，2017）。Guo等（2021）研究发现，5株野鸟源（孔雀、天鹅和野鸟）H9N2亚型AIV感染SPF鸡后可在其气管和肺脏中进行复制，同时具有在鸡群水平传播的能力。此外，张芳等（2015）分离获得1株对SPF鸡无感染性的野鸟源H9N2亚型AIV，但对SPF鸭有感染性且具有在鸭群中水平传播的能力。可见，野鸟源H9N2亚型AIV可不经体内适应而直接感染家禽，且具有在家禽间水平传播的能力，对家禽养殖业的健康发展造成了巨大潜在威胁。

由于野鸟源H9N2亚型AIV的HA基因在遗传进化上与现有疫苗株存在明显变异，具有在鸡群中水平传播的能力，即这些毒株具有在鸡群间大规模暴发流行的潜在可能性。因此，在日常的禽流感防控过程中应加强对麻雀等野鸟源AIV的监测，密切关注对家禽养殖影响较大的H9N2亚型AIV流行趋势及遗传变异动态，尤其是加强家禽饲养和流通环节的消毒与防护措施，尽量避免鸡、鸭等家禽与野鸟接触（崔鹏飞等，2016；Jin et al.，2020），切断AIV在不同野鸟与家禽间的传播途径，同时要尽快研发出与当前H9N2亚型AIV抗原性相一致的疫苗，进而减少禽流感暴发造成的经济损失和公共卫生安全威胁。