西柏三烯二醇分析、纯化及降解机理研究进展

杨元鑫, 阮建成, 边腾飞, 吴可君, 周少东, 钱 超

西柏三烯二醇分析、纯化及降解机理研究进展

杨元鑫1,2, 阮建成1,2, 边腾飞3, 吴可君1,2, 周少东1,2, 钱 超1,2

(1. 浙江大学化学工程与生物工程学院, 浙江杭州310027; 2. 浙江大学衢州研究院, 浙江衢州 324000;3. 浙江中烟工业有限责任公司技术中心, 浙江杭州310009)

,-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇作为重要的烟草香味前体物质，对烟草的香味调控具有重要作用，为了提升烟草品质，各国学者对西柏三烯二醇提纯、定量定性分析和降解机理进行深入的研究。作者详细介绍了西柏三烯二醇的提纯技术研究进展，包括蒸馏法和萃取法；并对西柏三烯二醇定量定性分析常用的高效液相色谱-质谱和气相色谱-质谱方法进行了简述；最后分析了西柏三烯二醇降解机理的研究，根据降解过程差异对比了3种途径的降解机理。在现有研究的基础上，最终提出了在提纯、分析及机理研究等方面的几个优化方法和方向，对更好调控烟草香味具有重要的指导意义。

西柏三烯二醇；分离纯化；定性定量分析；降解机理

1 前 言

,-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇，简称西柏三烯二醇(cembratriene-diols，CBT-diols)，是西柏烷类二萜化合物的一种，由4个异戊二烯单元相接而成[1]。西柏三烯二醇在烟草腺体分泌物中含量丰富，约占烟叶分泌物含量的60%[2]，在西柏三烯二醇降解产物中，茄酮、降茄二酮、茄尼呋喃等被认为是烟草香味的主要来源[3]，有研究显示香烟中加入西柏三烯二醇可以显著提升烟草香味和口感[4]。此外，西柏三烯二醇在抗肿瘤、保护神经系统等方面也有广阔的应用前景，可用于帕金森病、阿尔兹海默病、抗肿瘤等药物的开发[5-8]。

通过分离纯化技术从烟草中提取西柏三烯二醇，调控降解产生有调香作用的茄酮、降茄二酮等物质，可提升烟草品质[9]。卷烟中西柏三烯二醇含量不同，可产生不同的卷烟味感，因此建立快捷灵敏的西柏三烯二醇分析技术对烟叶品质控制有重要意义[10]。目前纯化分析西柏三烯二醇的方法各有特色，但仍存在衍生化试剂残留、溶剂回收率低、检测灵敏度低、前处理繁琐等缺点[11-12]。本文总结和介绍了西柏三烯二醇各类分离纯化方法、定性定量分析技术发展近况以及西柏三烯二醇的降解机理研究进展，展望了西柏三烯二醇的研究方向，为西柏三烯二醇的更深层次研究以及应用提供参考。

2 西柏三烯二醇分离纯化方法

烟草中化合物种类繁多，如不经分离纯化，卷烟会有粗糙、干涩等不适感，影响烟草品质。烟草中提取西柏三烯二醇的方法按照化工单元操作可以分为蒸馏法和萃取法，两者优劣对比如表1所示。

表1 西柏三烯二醇的分离纯化方法

2.1 蒸馏提取烟草中西柏三烯二醇

水蒸气蒸馏，以水蒸气提取烟草中的挥发性、半挥发性物质，经过冷凝后可以提取烟草中的部分香料物质[13]。作为传统的提取方法，水蒸气蒸馏在分离纯化烟草过程中，虽然有着分离纯化效果稳定的优势，但是也存在着溶剂消耗大、蒸馏效率低、操作时间长等缺陷，因此该方法逐渐被同时蒸馏法淘汰[14]。

蒸馏法是1964年由Likens和Nickerson提出，该方法结合了萃取与蒸馏的优点，节约了萃取溶剂的同时提高了萃取效率[15-16]。但是存在回流时间过长以及回流温度过高的问题，对温度比较敏感的香味成分可能会降解成不饱和醛等物质[17]。

减压蒸馏法可以有效降低温度的影响，李小福等[18]使用减压蒸馏法和同时蒸馏法对烟草的香味成分进行对比试验，发现减压蒸馏法对西柏三烯二醇具有更好的提取能力，而在以苯甲醇标样代替香味物质的溶剂回收实验中，同时蒸馏法比减压蒸馏法的溶剂回收率更高，两者回收率分别为82.96%，62.93%。

分子蒸馏由于具备蒸馏温度低、无鼓泡现象等优点，在处理量较少的情况下有较好的效果。然而由于分子蒸馏技术处理能力小，不能够大规模应用[12, 19]。

2.2 萃取提取烟草中西柏三烯二醇

有机溶剂萃取法作为传统的分离方法，国家标准YC/T 470-2013[22]中将烟叶浸润在二氯甲烷中，减压浓缩，获得粗提物浸膏，沉淀离心后通过硅胶柱层析得到西柏三烯二醇。张忠锋等[23]在专利中以此方法从烟草花序中浓缩提取西柏三烯二醇，拓宽了烟草中分离西柏三烯二醇的原料来源，但该法各步骤耗时较长，效率不高。

索氏提取法也是最常用的萃取方式，由于索氏抽提所用的溶剂可能会夹杂在产品之中，仍需要进一步的分离，这样使得索氏提取法所耗的时间延长，但索氏抽提法具有较高的回收率，仍受到研究者的青睐。刘清梁[17]提出自动索氏抽提，该法分为沸腾、淋洗、回收、预干燥4个阶段，减少了萃取剂用量以及萃取时间。

超临界流体萃取法由于高效的传质能力，具备高效分离能力，目前已经有较为成熟的工艺指标，何康[20]建立了超临界CO2萃取烟花中西柏三烯二醇的工艺，并在优化条件42 ℃、13.9 MPa下得到97.05%的西柏三烯二醇提取率。

2.3 多技术联用提取烟草中西柏三烯二醇

为进一步提高分离效率，储国海等[24]以传统溶剂法与超声振荡相结合，检测出烟草中112种香味物质，Qian等[25]采用加速溶剂萃取法，通过升温加压等方法加速萃取过程，大幅缩短了萃取所用时间，相比传统的有机溶剂提取法，西柏三烯二醇的回收率大幅提高，熊国玺等[21]将超临界萃取、分子蒸馏结合起来，可全程低温下提取烟草中的西柏三烯二醇。

蒸馏萃取技术的有机结合，可以同时提高西柏三烯二醇的提取过程的效率以及溶剂回收率，提取后则可根据烟草品级、生长环境的不同，灵活地选择合适的纯化方法[26]。分离技术随着科研、生产环境的变化应继续推陈出新，低消耗、高效率、操作更便捷的纯化分离技术是科研技术人员继续追求的目标。

3 西柏三烯二醇定性定量分析

柱色谱法，薄层色谱法以及X射线衍射等分析方法在定性定量分析西柏三烯二醇的研究中均有运用[27]，Roberts等[28]通过硅胶色谱柱和氧化铝色谱柱定性分离出-西柏三烯二醇和-西柏三烯二醇，也有学者采用X-射线单晶衍射方法和臭氧氧化法确定了西柏三烯二醇的绝对构型，之后较多采用X-射线单晶衍射方法检测该类化合物构型[29-30]。

随着对检测效率要求的提高，以上方法由于检测灵敏度不高、操作繁琐、检测效率低等缺点，现较多采用更快捷、高效的气相色谱、液相色谱以及质谱实现对西柏三烯二醇的定性、定量分析[11]。

3.1 气相色谱-质谱联用分析法

气相色谱-质谱(gas chromatography -mass spectrometer，GC-MS)的联用，实现了混合物组分的分离与定性定量检测功能的有机结合，充分发挥了气相色谱对混合物的分离能力和定量分析能力以及质谱对化合物的定性检测功能。Severson等[31]预先对西柏三烯二醇进行硅烷衍生化处理，然后采用GC-MS实现对西柏三烯二醇的检测。Loughrin等[32]对烟草中挥发性、半挥发性成分进行分析。为改进检测效果，Wei等[33]采用中柠三C3L、中桔三C3F等级的烤烟[34]，以自制的西柏三烯二醇作为标准，通过优化衍生化条件，建立了更高重现性的GC-MS分析方法，取250 μL不同浓度的标准物，加入3组烟草样本中，分析西柏三烯二醇的加标回收率，结果如表2所示，表中C3L和C3F分别为加入C3L和C3F烟草样品中的标准物浓度值。从表中可看出，该方法加标回收率在93%～107%，相比传统分析方法，操作更简便、分析更精准。

表2 Wei等[33]所提方法的回收率

3.2 高效液相色谱-质谱联用分析

高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)具备操作简单、分离效果好、检测灵敏度高等优点，在西柏三烯二醇的检测过程中被广泛使用。刘清梁[17]以20R人参皂苷Rh2作为内标物，以高效液相色谱-紫外检测法半定量分析了烟叶中的西柏三烯二醇含量。付秋娟等[11]优化了高效液相色谱法前处理流程，使用弱极性溶剂乙酸乙酯提取烟草中西柏三烯二醇，并进行了加标回收率重复实验，得到-CBT-diols和-CBT-diols的回收率平均值分别在96.7%～98.8%、96.2%～98.4%，重复实验数据如表3所示，表中RSD为相对标准偏差，RSD越小则表示方法的重复率越高。

表3 高效液相色谱法回收率[11]

3.3 多维色谱联用分析

气相色谱和高效液相色谱对复杂样品全组分的分析仍有不足，为提高对复杂样品的全组分的分析能力，有学者采用多维色谱联用技术对西柏三烯二醇进行分析：采用反相液相色谱柱分析并除去待测样品中大部分杂质，样品中的西柏三烯二醇被稀释并被富集在捕集色谱柱上，经二维分离后在紫外检测下对西柏三烯二醇进行测定[35-37]，该方法中-CBT-diols和-CBT-diols最低检测限分别为0.027和0.020 mg×g-1，具备较高的准确度和重现性。黄志等[38]联用HPLC-GC/MS实现了在线高效检测分析西柏三烯二醇，该方法通过第一维凝胶渗透色谱除去了待测样品中干扰检测的大分子色素，第二维GC/MS进一步实现了对西柏三烯二醇衍生物的检测。通过多维HPLC/GC-MS联用技术分析西柏三烯二醇，具备分离效果好、检测精度高、步骤简便等优点，为西柏三烯二醇的研究提供了技术支撑。

4 降解机理

4.1 降解产物组成

研究显示，烟草中所含的40多种西柏烯类化合物，绝大多数可以通过西柏三烯二醇经过简单的氧化、脱水裂环、酸碱重排等过程生成，西柏三烯二醇经酶促反应或者加热降解后的产物主要为C8～C18不同原子数的香味成分[39-44]。目前主要观点认为[2, 45]西柏三烯二醇生物降解产物主要成分为茄酮，茄酮经过进一步的降解可以生成茄尼呋喃以及其他香味物质。茄酮以及茄尼呋喃等西柏三烯二醇降解后的产物对调控烟草香味具有重要意义。

4.2 降解活性位置

Raldugin等[46-49]研究了氧化铬在丙酮水溶液和Jones试剂中氧化西柏三烯以及用过氧化物环氧化西柏三烯双键的过程，认为西柏三烯二醇更容易生成8、9号位环氧产物。Wahlberg等[39]认为，西柏三烯二醇中双取代的13、14号位双键对单线态氧的反应性低于三取代的4、5号位和8、9号位双键，且由于羟基去活化作用在C-6的基团上，致使8、9号位双键比4、5号位双键更容易反应。对此，Arnarp等[48, 50]探究了烟草中西柏烷类化合物经过酶促反应的结果，实验结果如图1所示，证实了8、9号位双键更容易环氧化。

4.3 茄酮降解途径

Demole等[51]对西柏三烯二醇经过酶催化或者加热降解生成茄酮之后的去向做出了如图2所示的描述，认为西柏三烯二醇在8、9号位双键氧化断裂后生成茄酮，之后可能转化途径有以下3种：经过单线态氧化作用生成环状的茄尼呋喃；茄酮双键位置可能发生氧化反应生成具有香味的杂环化合物；羰基位置也可以经碱性还原、氧化、酸化、氧化过程生成-异丙基丁酸内酯。其中，3种途径降解后生成的茄尼呋喃、杂环化合物以及异丙基丁酸内酯均是烟草中重要的香味化学品。

图1 西柏三烯二醇酶促降解试验结果[48, 50]

图2 西柏三烯二醇生物降解过程[51]

5 结 语

随着我国烟草行业进步发展的同时，消费者对烟草的香味、口感等方面要求更加严格，为提高香烟品味，开发高效、准确的西柏三烯二醇分离纯化和分析技术，进一步明确西柏三烯二醇的生物降解机理以及降解过程的影响因素，为此本文认为以下3个方面将会是未来的研究发展热点：

(1) 目前已有的传统纯化分离方法虽然分离效果稳定，但是溶剂回收率以及分离效率仍需提高，超临界萃取等环境友好型分离方法由于传质效率高，过程绿色、安全，发展较为迅速，但目前仅超临界CO2萃取分离应用较广，对如甲醇、乙烷等其他超临界流体的工艺开发较少。开发新的高效分离纯化方法，如新型超临界流体萃取工艺，是将来分离技术的发展方向之一。

(2) 运用多维色谱与质谱，实现多维度、高效率分离烟草中的化学物质和更高精度的定性分析。常用的气相色谱-质谱，高效液相色谱-质谱虽然已经具备较高的分离检测能力，但对复杂样品的全分离和分析能力仍有不足。继续发展多维色谱-质谱，在更高的分离能力基础上实现烟草物质的高效、准确检测对于西柏三烯二醇的研究具有重要意义。

(3) 近些年，原位红外和原位核磁在反应机理的应用已经非常广泛[52-55]，为了进一步探索西柏三烯二醇降解的反应机理，可使用傅里叶原位红外实时监测降解过程官能团的变化情况，利用原位核磁监测降解过程中化学键的变化。这些新技术的应用，可以有助于提出更全面可靠的降解理论，对应地提出实现调控降解过程的方法，为选择性生成香味成分或者化学手段合成香味成分进一步夯实理论基础。

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Research progress on analysis, purification and degradation mechanism of cembratriene-diols

YANG Yuan-xin1,2, RUAN Jian-cheng1,2, BIAN Teng-fei3, WU Ke-jun1,2,ZHOU Shao-dong1,2,QIAN Chao1,2

(1. College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China;2. Institute of Zhejiang University-Quzhou, Quzhou 324000, China;3. Technology Center, China Tobacco Zhejiang Industrial Co. Ltd., Hangzhou 310009, China)

,-4,8,13-cembratriene-1,3-diols, as an important tobacco flavor precursor, plays a crucial role in tobacco flavor regulation. The purification, quantitative and qualitative analysis and degradation of the flavor precursor were well studied for improving the quality of tobacco. The purification technology of cembratriene-diols was reviewed in detail, including distillation and extraction process. The quantitative and qualitative analysis by thehigh performance liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS) and the gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) were briefly introduced. Finally, the degradation mechanism of three pathway of cembratriene-diols was described and compared. Several development directions in purification, analysis and mechanism study were proposed.

cembratriene-diols; separation and purification; qualitative and quantitative analysis; degradation mechanism

TS411

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2022.01.001

1003-9015(2022)01-0001-08

2021-03-30；

2021-05-21。

国家自然科学基金(21878265)。

杨元鑫(1996-)，男，山东临沂人，浙江大学硕士生。

周少东，E-mail：szhou@zju.edu.cn

杨元鑫, 阮建成, 边腾飞, 吴可君, 周少东, 钱超. 西柏三烯二醇分析、纯化及降解机理研究进展[J]. 高校化学工程学报, 2022, 36(1): 1-8.

：YANG Yuan-xin, RUAN Jian-cheng, BIAN Teng-fei, WU Ke-jun, ZHOU Shao-dong,QIAN Chao. Research progress on analysis, purification and degradation mechanism of cembratriene-diols [J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 2022, 36(1): 1-8.