鞘磷脂酶在肝细胞癌中的作用

姚 春， 张广发， 乐滢玉， 毛德文， 张荣臻， 刘 茵

1 广西中医药大学 研究生院， 南宁 530222； 2 广西中医药大学第一附属医院 肝病一区， 南宁 530023

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是与癌症相关死亡的第4大常见原因，也是最常见的原发性肝癌，占所有病例的85%～90%[1]。HCC的病因病机尚未完全明晰，但多与肝炎病毒感染、肝硬化、代谢相关脂肪性肝病、酒精性肝病、糖尿病以及各类致癌物质等密切相关，其中肝硬化以及未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎是我国HCC发病的主要病因。肝硬化是HCC发生过程中最重要的环节，85%～95%的HCC具有肝硬化背景，而慢性HBV相关肝硬化是我国HCC的首要病因[2]。该病具有起病隐匿、发病迅猛、预后极差、恶性率及转移率高等特点，并且早期缺乏典型的症状和特异性的检测指标，这给疾病的早期诊断及治疗带来困难，也给患者的经济及社会医疗带来沉重负担，俨然已成为威胁全球公共卫生健康的难题。因此，进一步深入研究HCC的发病机制，寻找新的潜在诊断标志物以及疗效确切的治疗药物显得尤为重要。

鞘脂(sphingolipids,SL)是一类以鞘氨醇为基本骨架的生物膜结构组分，在动植物及微生物中广泛存在。SL种类繁多，其中神经酰胺 (ceramide,Cer)和1-磷酸鞘氨醇是处在鞘脂类代谢网络中核心位置的脂质生物调控分子，具有调节细胞生物学功能的重要作用，参与基因表达、细胞增殖分化及凋亡等多种生物学过程。Cer可由丝氨酸和棕榈酰辅酶A在内质网中重新合成或由鞘磷脂酶(sphingomyelinases,SMase)水解鞘磷脂 (sphingomyelin,SM)等不同途径产生[3]。Cer作为诱导性刺激过程中起关键性作用的第二信使, 在细胞信号传导中起重要作用，其通过参与和介导肝癌细胞的凋亡过程而抑制肝癌的生长；相反，1-磷酸鞘氨醇则能拮抗Cer的促凋亡作用, 并可通过刺激血管的生长而促使肿瘤的形成[4]。SMase是调节鞘磷脂类信号通路及其相关产物代谢的主要酶类，参与了SM复杂代谢过程中的关键步骤。近年来，许多研究表明SMase与HCC的发生发展密切相关，SMase可通过调节肿瘤干细胞的凋亡和增殖来促进肝脏肿瘤的发展。本文就SMase在HCC发生发展中的确切作用进行归纳和探讨，以期为其临床治疗提供新的思路和参考。

1 SMase的分类和生物学特性

根据酶促反应的最佳pH值和亚细胞定位，SMase包含3个类型：酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASMase)、中性鞘磷脂酶(neutral sphingomyelinase,NSMase)和碱性鞘磷脂酶(Alkaline sphingomyelinase,Alk-SMase)[5]。ASMase是由Smpd1基因编码的鞘磷脂类代谢的溶酶体酶，其酶促活性最佳pH值为4.5～5.0，在各种类型的细胞中广泛表达[6]。根据前体蛋白转运途径的不同，将ASMase分为细胞内溶酶体型和细胞外分泌型2种形式[7]。溶酶体型ASMase主要通过溶酶体途径水解产生，分泌型ASMase主要通过高尔基体分泌途径运输而产生；ASMase的产生所涉及的机制尚未完全明晰，但多与Zn2+有关，溶酶体型ASMase 需移位至质膜上与细胞外Zn2+结合才能被激活，分泌型ASMase在胞内与外源性Zn2+结合完成酶促活化[8]。ASMase的主要作用是催化SM转化为Cer和磷酸胆碱，参与细胞增殖分化、存活和通透性等多种信号传导过程，并在介导衰老、凋亡和自噬方面也发挥着关键作用[9-10]。

NSMase是神经鞘磷脂水解酶家族的重要成员，生理值(pH=7.4)是其激活的最适环境，同时钙、锰、镁阳离子在调节NSMase生物学活性中也发挥着关键作用。研究[11-13]发现，在哺乳动物细胞中存在3种亚型NSMase，分别是由Smpd2、Smpd3和Smpd4基因编码的NSMase-1、NSMase-2和NSMase-3，NSMase-1主要存在于内质网和高尔基体中，NSMase-3主要存在于骨骼肌和心肌细胞中而在肝脏中则不存在，而NSMase-2广泛存在于质膜的胞质面，在质膜的胞质面、多层体和核膜上通过特异性水解SM的磷酸胆碱头基从而调控胞内第二信使Cer水平。此外，NSMase-2受TNFα和IL-1β细胞因子调控，参与介导细胞应激和炎症反应[14]。

Alk-SMase是一种在肠道黏膜中表达(人体肝脏中也有表达)的细胞外酶，主要存在于胃肠道和人体胆汁中，具有组织表达特异性、胆汁盐依赖性和胰酶消化抵抗性等特点。研究[15-16]表明，Alk-Smase通过水解SM产生凋亡分子Cer，具有抗炎、抗癌和调控细胞增生凋亡等作用，并可作为肝胆疾病早期诊断的标志物。

2 SMase的信号传导和调控机制

SMase的酶活性可导致Cer在特定的离散胞内位点快速而短暂的释放，但NSMase和ASMase作用的机制与信号通路途径有所不同。NSMase和ASMase位于不同的双膜层中，它们分别在质膜和溶酶体中水解特定的SM。NSMase诱导的Cer在质膜附近生成，主要激活蛋白激酶C δ亚型、Ras激酶抑制因子或c-Jun氨基末端激酶等特定靶点，参与细胞生长、凋亡和癌症等生物学过程。ASMase激活产生的Cer已被证明能够靶向MAT1A基因和组织蛋白酶D以及c-Jun氨基末端激酶，并参与调节自噬、肝纤维化和溶酶体膜通透性。分泌型ASMase在水解质膜外叶处的SM过程中，产生的Cer会诱发细胞凋亡抑制因子CD95和脂肪酸合成酶配体结合，从而进一步介导脂肪酸合成酶诱导肝损伤和衰竭。

2.1 中性鞘磷脂酶(NSMase) NSMase 的不同亚型之间的同源性较低，参与镁结合和催化活性的关键残基(“催化核心”残基)均高度保守，因此几乎所有亚型的NSMase的催化活性都强烈依赖于镁或锰等阳离子。NSMase-1是一种具有423个氨基酸的完整膜蛋白质，分子量为 47.6 kDa，在氨基酸序列上与肌醇磷酸鞘脂酶C显示出显著的同源性，而在C端具有两个假定的跨膜结构域。研究[17]表明，NSMase-1 对于应激反应中的Cer生成起重要作用。在T淋巴细胞杂交瘤细胞中，通过反义RNA特异性抑制NSMase-1可减少T淋巴细胞受体介导的细胞凋亡，降低T淋巴细胞受体应答过程中的Cer水平、IL-2的产生和促分裂原活化蛋白激酶的激活。因此，NSMase-1衍生的Cer可能是T淋巴细胞受体信号机制的重要组成部分。此外，在斑马鱼胚胎细胞中，通过反义寡核苷酸抑制NSMase-1抑制了Cer的生成、caspase-3的活化和热应激诱导的细胞凋亡[18]。NSMase-2是一种具有655个氨基酸的蛋白质，分子量为71 kDa，具有C端催化结构域、两个 N 端疏水片段，两者之间有200个残留的胶原样三螺旋。NSMase-2作为一种磷蛋白，其活性除了对中性pH和二价阳离子有特殊要求之外，还受磷酸化、脂质结合及信号蛋白结合等多种途径调控，并参与细胞凋亡、生长抑制、炎症反应等多种生理病理学过程[19]。在MCF-7细胞中，柔红霉素可特异性上调NSMase-2 mRNA和蛋白质表达水平，NSMase-2启动子区域中的某些Sp1基序在柔红霉素的转录以及细胞死亡诱导中发挥关键作用，而对NSMase-1和NSMase-3没有任何影响[20]。此外，NSMase-2还与细胞生长抑制和肿瘤发生密切相关。研究[21]表明，细胞融合通过视网膜母细胞瘤蛋白的低磷酸化和细胞周期抑制因子p21的诱导，过表达NSMase-2的细胞在指数期后期表现出较慢的细胞生长，证实了NSMase-2在细胞生长调控中的作用。NSMase-2 mRNA和蛋白质表达水平的上调导致G0/G1期细胞周期阻滞，抑制了细胞周期的进展。此外，Cer水平增加，特别是在极长链C(24∶1)和C(24∶0)的Cer水平[21]。因此， NSMase-2是调节炎症、细胞生长和凋亡等生物学过程的潜在靶点，在癌症发生发展中扮演重要角色。

2.2 酸性鞘磷脂酶(ASMase) ASMase介导的Cer生成调控多种信号通路，在细胞代谢、Ca2+调节、自噬和溶酶体稳态等方面起着重要作用。因此，ASMase是调节多种细胞过程的重要信号分子。

内质网是蛋白质合成、折叠、成熟和分泌的重要细胞器。内质网应激(endoplasmic retieulum stress，ERS)是指内质网中错误折叠蛋白的积累从而触发非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。UPR是一个复杂的信号网络，旨在通过减少蛋白质合成和增加蛋白质折叠来恢复蛋白质稳态[22]。此外，细胞还可以通过UPR激活一系列信号通路来维持内质网稳态。UPR的激活是通过转录因子6a、蛋白激酶R样内质网激酶 (PERK) 、肌醇需求酶1α (IRE1α) 3种跨膜受体信号蛋白和主要调节因子葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)介导的[23-24]。在生理条件下，GRP78与 IRE1α、PERK 和 ATF6结合并阻止其激活, 然而错误折叠的蛋白质积累后GRP78被释放，转录因子6a、PERK、IRE1α启动UPR。经外源性 ASMase 处理的肝细胞可通过Cer的产生和对 Ca2+信号的影响以诱导内质网Ca2+稳态的失衡，Ca2+由Cer触发释放到细胞质中会抑制GRP78与UPR传感器的结合能力，从而导致ERS[25]。

自噬是一个高度调控和复杂的分解代谢过程，通过自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，参与功能失调细胞成分的降解，如线粒体及过氧小体细胞器、蛋白质聚集体或炎症小体[26]。自噬介导了许多肝脏疾病的进展，其中自噬缺陷可促进脂肪变性和纤维化发展进程[27]。ASMase在自噬介导的肝损伤中发挥作用，来自ASMase-/-小鼠的肝细胞表现出自噬通量的受损，具体表现为线粒体功能失调的积累和对高脂饮食诱导的肝脂肪变性的抵抗[28]。

溶酶体是专门的膜结合细胞器，含有多种水解酶，其在细胞死亡调节中起着至关重要的作用，其中溶酶体膜通透性和溶酶体内容物的泄漏足以引发细胞凋亡[29]。ASMase 缺乏会导致原代小鼠肝细胞对棕榈酸 (palmitic acid, PA)诱导的脂毒性产生耐药性。与对PA介导的脂肪毒性的抵抗一致，来自ASMase-/-小鼠的肝细胞也对两亲性溶酶促洗剂诱导的细胞死亡产生了抵抗。ASMase缺乏时溶酶体中胆固醇水平的增加参与了这种保护，因为降低溶酶体胆固醇含量会逆转ASMase-/-肝细胞对两亲性溶酶促洗剂和PA诱导的细胞死亡的耐药性[28]。因此，ASMase的缺乏会上调溶酶体胆固醇，从而导致溶酶体膜通透性的减少和对PA诱导的脂肪毒性的抵抗。

3 SMase与HCC

HCC早期症状不明显，确诊时多数患者已处于晚期而错过手术治疗的最佳时机。目前，有效的非手术治疗手段有限且效果欠佳，而且晚期 HCC 会对化疗产生耐药性，故早期诊断对HCC患者提高生存率至关重要[30-31]。肝细胞凋亡抵抗和代偿性增殖是HCC发生发展的关键驱动因素，也是治疗失败的主要原因。因此，寻找促进细胞凋亡和抑制 HCC 生长的分子靶点显得极为迫切，而SMase在HCC的发生发展及诊疗中具有重要潜在生物学价值。

3.1 NSMase在HCC中的作用 SL因参与调节癌细胞增殖和凋亡以及对化疗药物的反应而受到认可，Cer是SL代谢的核心分子，参与细胞凋亡、细胞周期停滞、细胞增殖、细胞迁移、衰老和炎症等生物学过程。因此，参与 Cer 合成分解代谢的相关基因、酶和脂质也在癌症进展中发挥重要作用。SL可以通过介导细胞凋亡途径，靶向调控Cer水平，从而抑制HCC的进展。研究[32]表明，与非肿瘤组织相比，HCC组织中的Cer水平显著降低而SM表达水平较高。因此，SMase活性受损可能是其潜在机制之一。此外，塞来昔布通过介导ERS激活诱导Cer从头合成，从而增强肝癌HepG2细胞的凋亡，抑制肝癌的进展[33]。研究[34]表明 ，NSMase-1在 HCC 中下调并与 HCC 患者的预后密切相关，与高 NSMase-1 患者相比，低 NSMase-1 表达的 HCC 患者的生存时间更短。外泌体 NSMase-1通过外泌体分泌降低体外SM/Cer 比率从而抑制HCC细胞生长并诱导细胞凋亡，表明NSMase-1 在抗 HCC 药物研发应用方面具有巨大的潜力，并可作为 HCC 患者的潜在预后生物标志物。NSMase-2为HCC的肿瘤抑制因子，NSMase-2 的过表达使 HCC 细胞系中的细胞增殖降低50%；相反，敲低NSMase-2 可促进体外细胞侵袭和迁移，并增加体内肿瘤形成[35-36]。此外，NSMase-2表达下调会抑制 TNFα介导的单核细胞/巨噬细胞的炎症反应，减少IL-1β、单核细胞趋化因子等炎性细胞因子的分泌[37-38]，并参与多种炎症疾病的发生发展。

3.2 ASMase在HCC中的作用 ASMase受紫外线照射、肿瘤坏死因子、氧化应激和抗癌药物等多种外源性刺激能迅速活化[39-40]，并由细胞内移位到胞膜上水解膜上SM生成Cer和磷酰胆碱。研究[41-42]表明，缺乏ASMase的细胞或小鼠能够抵抗抗肿瘤刺激诱导的细胞凋亡，而过表达 ASMase 会增加癌细胞对化疗和放疗的敏感性，表明ASMase是抗癌治疗的一个潜在靶点。

SL和 SMases通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路和自噬的相互作用介导参与HCC 的发病机制。mTOR是调节肿瘤细胞增殖、代谢和生存的必要复合物之一，其组装成两个不同的复合物：mTORC1和mTORC2[43]。Xu等[44]研究表明，mTORC2/Akt1(蛋白激酶1) 级联反应在原癌基因 c-Myc 诱导小鼠和人类HCC发生发展中至关重要， mTORC2通路的表达上调可以通过刺激脂肪酸和脂类的从头合成途径，从而诱导脂肪变性和HCC的发生发展。虽然自噬是一种为能量生成提供营养物质以维持关键细胞功能的机制，但自噬在HCC中似乎起着自相矛盾的作用。已有研究[45]证明，自噬可以保护癌细胞免受受损细胞器和蛋白质聚集的堆积，防止细胞死亡和癌症治疗的毒性。此外，通过药物或腺病毒小干扰RNA介导的自噬抑制可使HCC细胞对多激酶抑制剂 Linifanib 敏感[46]。然而，自噬标志物的减少与更具侵袭性的HCC的发病机制和进展相关，Beclin-1和Bax在HCC组织中的表达可能对抑制 HCC 增殖、浸润、转移和血管生成提供协同作用[47]。研究[48]表明，在影响自噬的药物中，伏立诺他和索拉非尼可通过ASMase/Cer依赖途径增加ERS与自噬来促进HCC癌细胞凋亡。此外，重组人ASMase作为索拉非尼治疗 HCC 的潜在辅助治疗制剂，重组人ASMase联合索拉非尼在减少Huh7异种移植物中的肿瘤体积、促进肿瘤细胞坏死以及降低血管密度方面表现出协同作用，并且其安全性和耐受性良好[49]。因此，ASMase具有作为HCC潜在疗法的靶向性。

4 小结与展望

综上所述，SMase作为一种新型的潜在治疗靶点，其在细胞凋亡和增殖、细胞周期停滞、细胞迁移和炎症等生物学过程中的确切作用已得以阐述，并与HCC的发生和发展密切相关。但仍存在以下不足之处：(1)SMase在HCC中的具体分子机制仍未完全明晰且大多研究仍停留于实验研究阶段，距离疾病的临床评估和药物开发等实际应用还有一定的差距；(2)目前，SMase在HCC中研究多集中于NSMase 和 ASMase，而Alk-SMase对HCC发生发展的相关研究鲜有报道；(3)SMase对HCC非癌细胞的影响尚不明确。因此，未来急需进一步深化基础研究，尤其是Alk-SMase对HCC发生机制的确切作用，并开展临床应用验证，更加细化的深入探索SMase在HCC不同阶段、不同细胞中的作用和机制。相信随着SMase对HCC研究和认识的深入，SMase有望成为HCC新型的预测因子和药物治疗靶标，为HCC的早期诊断、靶向治疗及预后评估等方面提供新策略。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：姚春、张广发负责拟定写作思路，撰写文章；毛德文负责研究选题，指导文章撰写和修改；张荣臻、刘茵负责设计论文框架；乐滢玉负责起草论文。