基于CNCPS6.5的泌乳早期奶牛乳真蛋白质产量对可代谢蛋氨酸供应量的Meta分析

高 巍，刘晨黎

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000)

乳蛋白是乳汁中真蛋白质(包括酪蛋白和乳清蛋白)和非蛋白质含氮化合物(包括尿素、氨、氨基酸、尿酸、肌酸和肌酐等)的统称。乳中真蛋白质含量(MTPC)约为93%。乳蛋白含有人体所需的所有必需氨基酸(EAA)和多种生物活性蛋白质，营养价值很高。因此，如何提高牛乳中真蛋白质含量和产量就是广大奶牛生产和科研人员尤为关注的问题。许多国家加大了牛奶多成分定价体系中乳蛋白的权重。我国最新发布的巴氏杀菌乳标准[1]将乳蛋白(≥2.9 g/100 g)列为一项主要指标。

相较于遗传选育来说，营养调控无疑是改善乳真蛋白质含量(MTPC)和产量(MTPY)的一种快速有效的手段。过瘤胃氨基酸保护性技术及其产品的问世，开启了改善MTPY与蛋白质转化效率，降低饲养成本和环境污染的营养“调控之窗”[2-4]。近半个世纪的研究结果表明，奶牛在饲喂青贮玉米和苜蓿基础日粮下，蛋氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)通常是对乳蛋白质合成限制作用最大的EAA，提出了代谢蛋白质中Met(Met%MP)和Lys(Lys%MP)含量分别达到7.2%和2.4%最佳[5-6]。关于MTPY对可代谢蛋氨酸供给量(mMetS)的剂量效应关系的meta分析表明，MTPY是可以由mMetS来预测的[7-9]。但是，上述meta分析没有区分奶牛的泌乳期，奶牛在不同泌乳期的剂量效应关系可能是不同的；其次，从瘤胃微生物蛋白质合成到乳腺中乳蛋白质的合成，都与代谢能(ME)的供应水平密不可分。ME供给不足，氨基酸可能会分解供能，蛋白质的转化效率降低。因此，以ME进食量为基础的mMetS来预测牛乳MTPY，明确ME和氨基酸供给量比例关系，可能预测效果更好。最后，日粮中添加瘤胃保护性氨基酸的饲养试验多采用纵贯设计，而瘤胃后灌注氨基酸的试验多为交叉设计(含拉丁方)，试验期普遍较短。试验设计类型对研究结果是否会产生干扰有待验证。基于以上分析，本文对泌乳早期荷斯坦奶牛的MTPY与mMetS的剂量效应关系进行了Meta分析。

1 材料与方法

1.1 文献检索、选择标准与日粮模型评价

在Web of Science检索平台上，以“lactating dairy cows”或“lactating dairy cattle”与“Methionine”或“metabolizable methionine”作为检索词进行文献检索，检索年代为1980年至今。另一个检索方式是从已发表的相关Meta分析[6-11]的参考文献中获取，尽可能最大范围地检索出相关研究文献，作为分析的候选对象。

文献筛选标准如下：(1)试验采用的是荷斯坦牛，提供了奶牛的体重、胎次及泌乳天数(DIM<120 d)、泌乳量及乳成分等指标的测量值；(2)奶牛饲喂以青贮玉米、苜蓿干草或青贮为基础的全混合日粮(TMR)，列出TMR日粮组成、营养水平及主要原料的主要营养成分信息和干物质采食量(DMI)；(3)补饲Met的来源为皱胃或十二指肠灌注DL-Met或日粮中添加瘤胃保护性蛋氨酸(RP-Met)且在CNCPS6.5饲料数据库中可调用的产品，如MetSmart，Alimet，Mapron，MFP，Smartamine M，Rhodimet AT88等，以便对TMR日粮进行模型评价。颈静脉灌注Met或其他新型RP-Met产品的试验报道排除在外。(4)试验设计有不添加或不灌注Met但饲喂相同日粮的对照组；(5)公开发表于纯学术的如《J.Dairy Sci.》，《J.Nutr.》，《J.Anim.Sci.》，《Anim.Feed Sci.Techn.》等国际知名期刊。

在CNCPS6.5模型的‘Cattle inputs’模块录入每篇文献报道的奶牛相关信息，如奶牛的品种、类型、体重、产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、试验期内的平均DIM等。MTPC未说明的，则按乳粗蛋白率乘以0.93来计算，用以计算MTPY。其他未明确报道的指标如年龄、胎次、妊娠与否等则统一设定为60月龄，胎次为3，未妊娠。在CNCPS6.5模型的饲料数据库中调取与文献报道类似的饲料原料，包括RP-Met产品等，在‘Feeds’模块中对每种饲料原料按文献报道的养分含量数值来录入，未报道的指标则按类似原料的信息来录入。在CNCPS6.5模型的‘Recipes’模块中按文献报道的日粮组成比例和奶牛DMI来拟合TMR日粮，最大限度接近原始文献报道的日粮营养水平，特别是DM%、ME与MP平衡状况、CP%与RDP%、NDF%与NFC%、矿物质与维生素ADE等是否满足其营养需要。要求达到模型预测值不超过文献报道数值的10%[9]。在CNCPS6.5模型的‘Locations’模块中输入牛舍环境与饲养管理信息，如文献中未明确说明，则按模型默认设置。

符合本研究筛选条件的文献共计20篇，含23项试验80个处理，其中对照30个，处理组50个。13项试验采用的试验设计类型为纵贯设计，平均试验期为(83.3±32.1)d，其余10项试验为交叉设计类型(含拉丁方设计)，平均试验期为(18.1±9.1)d。将上述文献的相关信息分别录入CNCPS6.5进行模型评价，并用SAS9.4的Univariate过程[12]对每一个指标进行单变量分析，结果详见表1。

表1 Meta分析文献数据集资料汇总(干物质基础)※

1.2 数据统计分析

为了解数据集中哪些变量可解释最大的方差变异，运用SAS9.4的Princomp过程进行主成分分析[12]。在此基础上，分别以mMetS(g/d)、Met%MP(%)或Met/ME(g/Mcal)作为自变量，以数据集中23项独立的试验作为随机效应，采用SAS9.4的NLMIXED过程拟合Logistic模型参数(群体上渐近线A、形状参数B和时间尺度k)。以试验方差、模型方差和AIC数值最小者为最优。运用拟合出的最优模型预测MTPY，对残差与预测值进行回归分析，分析预测模型偏差和RMSE值[13]。采用线性混合模型(mixed procedure)进行回归分析，消除单个试验的随机效应后，探索处理对MTPY的固定效应，建立预测回归方程。所用的统计模型为：

Yij=+Si+B1Xij+biXij+eij

式中：Yij为依变量；为总截距(固定效应)；Si为第i项试验的随机效应；B1为依变量Y对自变量X的总体回归系数(固定效应)；Xij为第i项试验中第j个连续型自变量的观察值；bi为第i项试验中Y对X的回归系数(随机效应)；eij为残差。Si、bi和eij均假定为独立随机变量[14]。为探讨试验设计类型(交叉设计与纵贯设计)是否与自变量存在互作影响，故在统计模型中引入一个二值分类变量M(M=c，代表交叉设计类型crossover design；M=l，代表纵贯设计类型longitudinal design)，并进行回归分析。统计模型为：

Yijk=+Si+j+Sij+B1Xij+biXij+BjXij+eijk

式中：j为分类变量M不同水平下的截距(固定效应)；Bj为分类变量M在不同水平下对自变量Xij的回归系数(固定效应)。其余同上。

代谢蛋白质中MET增量(△mMetS)的边际效率分析。本次Meta分析建立的数据集包含23项试验共80个处理，其中对照组30个，处理组50个。将每项试验中的每一个处理组与相应的对照组的MTPY、mMetS相减，即可得到△MTPY和△mMetS。牛乳蛋白质中Met的含量按2.76%计,则Met%MP用于乳蛋白质合成的净效率=(△MTPY×0.0276)/△mMetS。与此同时，根据非线性混合模型(NLMIXED)拟合出的Logistic模型的参数A、B和k计算边际效率=[ABe(-Met/k)]/k[1+Be(-Met/k)][7]。

2 结果与分析

2.1 主成分分析

前6个主成分的解释方差比例分别为30.3%、18.9%、12.97%、9.59%、7.24%和5.87%，累积解释方差达到了84.9%(图1)。第一主成分主要包括MP供给量、ME进食量和RUP%DM等变量。第二主成分包括了体重、CP%DM和RDP%DM。第三主成分主要包括mMetS、mMetS/ME比和Lys∶Met比。第四、五和六主成分主要为DIM、RDP%DM和NFC%DM。可以看出，与MTPY关系密切的饲粮因素主要是MP(含Met/Lys)与ME进食量、日粮蛋白质水平与蛋白质结构比例等，与其负相关的主要是碳水化合物成分(NFC、NDF等)。能量与蛋白质(含AA)之间的关系尤为密切。有鉴于此，本文重点以Met%MP、mMetS(g/d)以及mMetS/ME比作为Logistic模型自变量来预测MTPY。

图1 主成分分析陡坡图和已解释方差

2.2 非线性混合模型对乳中真蛋白质产量的预测

由表2看出，当以mMetS作为拟合的自变量时，模型拟合的试验方差、模型方差以及AIC值均最小，拟合效果最好。故后续分析中均以mMetS作为自变量来拟合的模型参数来预测MTPY。以mMetS为预测自变量时，Logistic模型参数A为1 333.7，与Vyas与Erdman[8]报道的数值1311非常接近，但高于Doepel等[7]报道的数值1 194。本文拟合的参数A值较高的原因是，我们是预测泌乳早期奶牛的MTPY。模型预测的MTPY的平均值为1 040.6 g/d，与Vyas与Erdman[9]的平均值1 058 g/d高度一致，而Doepel等[7]的平均值为738 g/d。造成这种差异的主要原因是，Doepel等[7]的数据集中排除了所有日粮添加RP-Met产品的试验，因为不能确定这些产品中的Met实际的可利用性数据。本文数据集中文献使用的RP-Met产品均是CNCPS6.5软件饲料数据库中收录的产品，其可提供的可代谢蛋氨酸的数量由模型预测生成。类似的，Vyas与Erdman[8]是采用NRC的预测模型来生成相关数据，这可能是本文的预测值与其比较一致的一个重要原因。

表2 NLMIXED过程拟合的Logistic模型参数(平均值±SE)

MTPY的观测值减去模型预测值所得残差与预测值的回归分析结果见图2。如图所示，残差与0轴的聚合程度不高，多数分布于±200 g/d范围内。个别值偏低，位于(-200)～(-400)之间，这是由于个别试验报道的MTPY过高所致。回归分析显示，MTPY预测存在斜率偏差，其中在预测的MTPY较低时，残差往往为负值(P<0.01)。此结果与Vyas与Erdman[9]的类似。在他们的Logistic模型预测值中，有两个处理组的MPY观测值过大，使得计算出的残差值极低，导致回归分析存在斜率偏差(残差=0.101×MPY-105.5，R2=0.38，P<0.01)。

图2 残差对MTPY预测值的回归分析(残差=-3365.2+3.2374MTPY，R2=0.1962)

2.3 混合模型回归分析

采用无结构(TYPE=UN)的协方差参数估计表明，随机效应中的截距和斜率无互作效应(协方差参数UN(2,1)项的P=0.9765)。故进一步采用方差分量法(TYPE=VC)分析。MTPY预测值经残差校正后(MTPY校正)，再与mMetS进行回归分析，得到预测回归方程：MTPY校正=(951.03±38.2)+(3.05±0.67)×mMetS(R2=0.1912，RMSE=143.2)。

二值变量M与自变量(mMetS)之间存在显著的互作关系(P=0.0231)。M取值为C时，也就是试验设立类型为交叉设计时，对试验的固定效应可能会造成干扰。由于本次Meta分析数据集只有23项试验，其中10项为交叉设计试验，数量很有限，还需要更多试验数据的验证分析。

2.4 △mMetS的边际效率分析

共有50个处理组的△MTPY和△mMetS值参与计算边际效率，剔除了7个异常值(负值)后，其余43个数值绘制散点图，如图4“*”所示。散点分布、PBspline样条曲线及直线回归均表明，随着小肠mMETs的增加，Met用于合成乳蛋白质的效率是逐渐降低的。其变化范围从最高70%到最低0.74%。此结果与之前的结果非常一致。Doepel等[7]报道小肠可代谢蛋氨酸转化为乳蛋白质中Met的效率由46%降低到14%，类似的，Vyas与Erdman[8]发现，当Met的供给量从25 g/d增加的70g/d时，小肠可代谢Met的边际效率从44%下降到12%。因为本分析的mMetS的范围比他们的更宽，下限更低，所以Met的边际效率的最高达70%。但平均为17.3%，中位数为12.6%。新版《奶牛营养需要》[1]将MP用于乳蛋白质合成的效率设定为67%，而本文和其他meta分析的结果均提示，MP中AA用于乳蛋白质合成的效率不是恒定不变的，而是随着AA供给量的增大，转化效率逐步降低的。

图3 混合模型下可代谢Met进食量与牛乳中真蛋白质产量的回归关系

图4 模型预测值与实测值计算边际效率对比

将数据集中的43个处理组的mMetS和Logistic模型参数(A、B、k)分别计算其边际效率，所得数值制作散点图，如图4中的“△”所示。用Logistic模型预测值计算得到的边际效率，其总体变化趋势与实际观测值的边际效率的趋势相同，也是随△mMetS的增大，边际效率逐步降低，但变化范围很窄，从5.38%到4.57%，平均5.03%，变异系数只有4.05%。Vyas与Erdman[8]同样采用Logistic模型参数计算的边际效率表明，当蛋氨酸的进食量从25 g/d增加到70 g/d时，MTPY的边际相应效率从16 g/d下降到4 g/d。造成这种较大差异的原因，我们认为可能主要是Meta分析的文献数据集的不同。Vyas与Erdman[8]的数据集没有区分奶牛的泌乳期。而本文的数据集是由20篇文献针对泌乳早期奶牛(DIM<120 d)进行的23项试验(含50个处理组和30个对照组)组成的。泌乳早期奶牛的泌乳机能旺盛，养分用于泌乳的净效率(扣除维持需要)很高，所以，△MTPY对△mMetS的响应的敏感度不高。

3 结论

本研究表明，对MTPY起正效应的饲粮因素主要是MP(含AA)和ME进食量，起负效应的饲粮因素主要包括碳水化合物成分如NFC或NDF等。但是，单一因素所发挥的决定性作用都不大，前6个主成分累积可解释的方差还不到85%。这就提示我们，奶牛乳蛋白质的合成是一个非常复杂的生理过程，受到多种饲粮因素的影响。

荷斯坦奶牛在饲喂玉米青贮、苜蓿干草或青贮等粗饲料的TMR日粮下，泌乳早期的MTPY可以由mMetS(g/d)来预测。预测效果优于mMetS/ME比或Met%MP。使用mMetS的优点是，在设计饲粮配方时，只需要考虑每头奶牛每天RP-Met产品的适宜添加量，而无须考虑由于DMI的变动而调整其在饲粮中的养分浓度。当然也需要了解，补饲RP-Met产品的边际效率会随补饲量的增加而降低，并非恒定不变的。

本研究还发现，试验设计类型为交叉设计时，对试验的固定效应可能会造成干扰，原因可能与交叉设计的试验期过短有关。