甲基莲心碱通过miR-3619-5p调控结核分枝杆菌诱导的THP-1凋亡及炎性反应的分子机制

谢玉瑾 宋雪云 马永春

结核的重要病原菌是结核分枝杆菌(MTB)，属于典型胞内菌感染，MTB侵入机体后可发展为活动性肺结核，机体通过分泌前炎因子而清除病原菌感染，但前炎因子可进一步加重机体损伤，因而减少炎性因子的释放，可有效改善持续性病原菌感染[1]。研究表明药物可发挥抗炎作用从而减轻MTB诱导的炎性反应[2,3]。甲基莲心碱属于双苄基异喹啉生物碱，具有抗氧化、抗炎等作用，并可通过调节线粒体膜电位从而调控细胞凋亡，还可抑制骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡[4]。但笔者查阅文献后发现关于甲基莲心碱对MTB诱导的人单核细胞(THP-1)凋亡及炎性反应的影响尚未可知。微小RNA(miRNA)在MTB诱导的人巨噬细胞中表达异常，并可调控细胞凋亡[5]。但miRNA在甲基莲心碱调控MTB诱导的THP-1细胞凋亡及炎性反应过程中的作用机制尚未阐明。BCG诱导的巨噬细胞中miR-3619-5p的表达水平降低，并可能参与病原菌感染过程[6]。但甲基莲心碱是否可通过调控miR-3619-5p的表达从而抑制病原菌感染尚未可知。因此，本研究采用MTB诱导THP-1源巨噬细胞建立细胞损伤模型，探讨甲基莲心碱对MTB诱导THP-1源巨噬细胞凋亡及炎性反应的影响，探究其对miR-3619-5p的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人单核细胞THP-1购自上海中科院细胞库；甲基莲心碱购自购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂购自北京天根生化科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-10检测试剂盒购自美国eBioscience公司；佛波酯(PMA)、细胞凋亡试剂盒购自美国Sigma公司；结核分枝杆菌(MTB)、MTB培养基购自美国BD公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗体购自美国Santa Cruz公司；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国Abcam公司；miR-con、miR-3619-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-3619-5p购自广州锐博生物技术有限公司；Lipofectamine2000试剂购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组:THP-1细胞(1×106个/ml)接种于6孔板(200 μl/孔)，加入PMA(20 ng/ml)刺激48 h后细胞转化为巨噬细胞[7]，将THP-1源巨噬细胞(1×105个/ml)接种于24孔板(100 μl/孔)，加入含10%胎牛血清的培养基内培养，待细胞贴壁生长后按照感染复数(MTB∶细胞=10∶1)感染巨噬细胞8 h[8]，PBS洗涤后加入含有庆大霉素的DMEM培养液继续培养24 h，记为MTB组。同时将正常培养的THP-1源巨噬细胞作为NC组。分别加入不同浓度(1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5.0 μg/ml)的甲基莲心碱培养基培养MTB感染的巨噬细胞24 h[9]，分别记为1.25 μg/ml Nef+MTB组、2.5 μg/ml Nef+MTB组、5.0 μg/ml Nef+MTB组。参照Lipofectamine2000试剂分别将miR-con、miR-3619-5p mimics转染至MTB感染的巨噬细胞，分别记为MTB+miR-con组、MTB+miR-3619-5p组。参照Lipofectamine2000试剂分别将miR-con、miR-3619-5p mimics转染至MTB感染的巨噬细胞，加入5.0 μg/ml 甲基莲心碱培养基培养24 h，分别记为anti-miR-NC+Nef+MTB组、anti-miR-3619-5p+Nef+MTB组。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率:取各组THP-1源巨噬细胞加入预冷PBS洗涤后弃上清，加入500 μl结合缓冲液重悬细胞后加入5 μl Annexin V-FITC后充分混匀，于37℃、体积分数5%CO2培养箱继续孵育10 min，加入5 μl PI后室温避光孵育10 min，应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α、IL-6、IL-10的水平:取各组细胞培养上清液，采用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-10的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 qRT-PCR检测细胞中miR-3619-5p的表达水平:采用Trizol法提取各组THP-1源巨噬细胞中总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度，RNA OD260/OD280处于1.8～2.0水平。反转录体系：RNA 2 μl，10×RT Buffer 2 μl，dNTP 0.4 μl，Multiscripe RT 1 μl，10×Random Primer 2 μl，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：25℃ 10 min，37℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃保存。以cDNA为模板进行qRT-PCR，反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl/孔，正反向引物0.8 μl/孔，cDNA 1 μl/孔，ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃预变性5 min循环1次，95℃变性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循环40次。应用美国ABI Step One Plus实时荧光定量PCR仪检测细胞中miR-3619-5p的表达水平。

1.2.5 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达:取各组THP-1源巨噬细胞加入适量RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用SDS-PAGE(10%)凝胶电泳分离蛋白，将其移至PDVF膜，脱脂牛奶(5%)封闭，分别添加Bax、Bcl-2与β-actin一抗(1∶1 000)，4℃孵育24 h，次日加入HRP标记的二抗(1∶5 000)，ECL化学发光法进行显影，Bax、Bcl-2均以β-actin为内参基因，并采用Quantityone软件检测条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。

2 结果

2.1 不同浓度甲基莲心碱对MTB处理的巨噬细胞凋亡率及凋亡蛋白的影响 与NC组比较，MTB组凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；与MTB组比较，1.25 μg/ml Nef+MTB组、2.5 μg/ml Nef+MTB组、5.0 μg/ml Nef+MTB组凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。见表1，图1。

表1 不同浓度甲基莲心碱对MTB处理的巨噬细胞凋亡率及凋亡蛋白的影响

图1 不同浓度甲基莲心碱对MTB处理的巨噬细胞凋亡率及凋亡蛋白的影响;A 流式细胞仪检测细胞凋亡;B Western Blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达

2.2 Nef对MTB处理的巨噬细胞炎性因子表达水平的影响 与NC组比较，MTB组TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高(P<0.05)；与MTB组比较，1.25 μg/ml Nef+MTB组、2.5 μg/ml Nef+MTB组、5.0 μg/ml Nef+MTB组TNF-α、IL-6、IL-10的水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 Nef对MTB处理的巨噬细胞炎性因子表达水平的影响

2.3 Nef对miR-3619-5p表达的影响 与NC组比较，MTB组miR-3619-5p的表达水平降低(P<0.05)；与MTB组比较，1.25 μg/ml Nef+MTB组、2.5 μg/ml Nef+MTB组、5.0 μg/ml Nef+MTB组miR-3619-5p的表达水平升高(P<0.05)。见表3。

表3 Nef对miR-3619-5p表达的影响

2.4 高表达miR-3619-5p对MTB处理的巨噬细胞凋亡和细胞炎性因子表达水平的影响 与MTB+miR-con组比较，MTB+miR-3619-5p组凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-10的水平降低(P<0.05)。见表4，图2。

图2 Western Blot检测Bax、Bcl-2表达

表4 高表达miR-3619-5p对MTB处理的巨噬细胞凋亡和细胞炎性因子表达水平的影响

2.5 低表达miR-3619-5p可以逆转Nef对MTB处理的巨噬细胞凋亡和细胞炎性因子表达水平的影响 与anti-miR-NC+MTB组比较，anti-miR-3619-5p+MTB组凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高(P<0.05)；与anti-miR-NC+Nef+MTB组比较，anti-miR-3619-5p+Nef+MTB组凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高(P<0.05)。见图3，表5。

图3 Western Blot检测Bax、Bcl-2表达

表5 低表达miR-3619-5p可以逆转Nef对MTB处理的巨噬细胞凋亡和细胞炎性因子表达水平的影响

3 讨论

甲基莲心碱能够减轻LPS诱导的人脐静脉内皮细胞的损伤，其机制可能与调节内皮细胞中NO的释放和NOS的活力有关[10]。甲基莲心碱通过miR-29a-3p/AQP4抑制Aβ1-42诱导的神经细胞损伤，促进细胞存活，并抑制细胞凋亡[11]。甲基莲心碱能减轻脑缺血再灌注损伤，其机制与抑制细胞凋亡及炎性反应有关[12]。本研究结果显示，MTB诱导的THP-1源巨噬细胞凋亡率升高，并可促进Bax表达及抑制Bcl-2表达，与相关文献报道[13]相似。提示成功构建模型。本研究结果显示，甲基莲心碱可明显降低MTB诱导的THP-1源巨噬细胞凋亡率，并可抑制Bax表达及促进Bcl-2表达，提示甲基莲心碱可抑制MTB诱导的THP-1源巨噬细胞凋亡。

IL-6、TNF-α、IL-10可调节机体免疫应答，其在机体中表达水平降低可调节细胞免疫功能及抑制肿瘤生长[14]。本研究结果显示，MTB诱导的THP-1源巨噬细胞中TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高，而甲基莲心碱处理后可明显降低TNF-α、IL-6、IL-10的水平，提示甲基莲心碱可抑制炎性反应从而减轻MTB诱导的THP-1源巨噬细胞损伤。

本研究显示，MTB诱导的THP-1源巨噬细胞中miR-3619-5p的表达水平降低，而甲基莲心碱可提高miR-3619-5p的表达水平，提示甲基莲心碱可能通过上调miR-3619-5p的表达发挥作用。研究表明miR-3619-5p在人胎道平滑肌细胞中呈低表达，可调控细胞增殖过程[15]。miR-3619-5p可抑制膀胱癌的进展[16]。circZFR通过调节miR-3619-5p/CTNNB1轴而促进肝癌的进展[17]。本研究显示，miR-3619-5p过表达可明显降低MTB诱导的THP-1源巨噬细胞凋亡及TNF-α、IL-6、IL-10的水平，而抑制miR-3619-5p表达可提高MTB诱导的THP-1源巨噬细胞凋亡及TNF-α、IL-6、IL-10的水平，提示miR-3619-5p过表达可抑制MTB诱导的巨噬细胞凋亡及炎性反应。本研究显示，抑制miR-3619-5p表达可逆转甲基莲心碱对MTB诱导的THP-1源巨噬细胞凋亡及炎性反应的作用。

综上所述，甲基莲心碱可通过上调miR-3619-5p的表达而抑制MTB诱导的THP-1源巨噬细胞凋亡及炎性反应从而缓解结核感染，甲基莲心碱可能具有缓解MTB诱导的炎性反应作用，并可能成为调节免疫反应的抗结核治疗的新药物。