荧光PCR 熔解曲线法对抗结核药物异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星耐药性的诊断价值

史剑权 高 珊 王 隽

1.首都医科大学附属北京胸科医院重症医学科，北京 101149；2.首都医科大学附属北京胸科医院结核内科，北京 101149

中国是世界上22 个结核病高负担国家之一，2019 年中国新发结核病83.3 万例，排名世界第二[1]。这其中，耐药结核病又是结核病防治的难点之一。因此，早期诊治耐药结核病就显得尤为重要；这对药物敏感性试验（drug susceptibility testing，DST）提出了较高要求。目前，DST 可分为分子（基因）DST 技术和表型DST 技术两种。传统的表型DST 是诊断耐药结核病的金标准[2]，但是表型DST 操作复杂，且实验周期可长达1～2 个月，不能及时为临床医师提供有效信息，这可能造成治疗的延迟[3-4]。近年来，随着分子生物学诊断技术的不断完善，包括PCR 熔解曲线法在内的分子DST 不断显示出其在诊治耐药结核病中的优势[5-6]。美国胸科协会在2019 年有关耐药结核病治疗的指南中，也进一步强调了对结核病患者及时获得表型DST/分子DST 的重要性[7]。然而，表型DST 和分子DST 与实际抗结核药的耐药情况存在一定差异，部分抗结核药DST 的可靠性和临床应用价值尚未完全确定[8]，仍有不少问题值得探讨。本研究以传统的罗氏培养DST（表型DST 中的一种）为金标准[3]，进一步探讨荧光PCR 熔解曲线法（是一种逐渐推广的分子DST）对常用抗结核药异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星耐药性的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性选取2018 年1 月至2019 年12 月首都医科大学附属北京胸科医院（以下简称“我院”）住院治疗的肺结核患者，合计170 例，其中男125 例，女45 例；平均年龄（45.3±18.2）岁。纳入标准：经三级医师查房，得到临床确诊；均同时进行了异烟肼、乙胺丁醇、喹诺酮药物的荧光PCR 熔解曲线检测，且具有同期的罗氏培养DST 结果。排除标准：合并非结核分枝杆菌肺病的患者。本研究经我院医学伦理委员会审核通过。

1.2 实验方法

表型DST（传统的罗氏培养DST）和分子型DST（荧光PCR 熔解曲线法）的结核菌耐药性检测均在北京结核病研究所参比实验室进行。结核菌罗氏培养DST 由改良的罗氏培养基培养。荧光PCR 熔解曲线法的检测试剂盒购自厦门致善生物科技公司。其中，INH 的耐药基因检测位点包括katG315 密码子、inhA启动子区（-17～-8 位点）、inhA94 密码子、ahpC 启动子（-44～-30 及-15～3 位点）。EMB 的耐药基因检测位点包括embB 基因306 位密码子、406 及497 位密码子。喹诺酮类药物耐药基因的检测位点为gyrA 基因88～94 位密码子。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对所得数据进行统计学分析，计数资料采用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。本研究中诊断试验的评价，通过应用MedCalc v19.5.1 软件，计算诊断试验中敏感性、特异性、符合率及其95%CI 等基本指标。采用Kappa 值反映诊断实验的一致性水平，采用受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）下面积（area under the curve，AUC）定量反映诊断实验准确性的大小。其中，Kappa 的判断标准[9]：Kappa≥0.75，两者一致性较好；0.4≤Kappa＜0.75，一致性中等；Kappa＜0.4，一致性较差。AUC 的判断标准[10]：0.5＜AUC≤0.7，说明诊断价值较低；0.7＜AUC≤0.9，诊断价值中等；AUC＞0.9，诊断价值较高。

2 结果

2.1 荧光PCR 熔解曲线法DST 与表型DST 对抗结核药物的药敏结果比较

在170 例患者中，荧光PCR 熔解曲线法DST 敏感而表型DST 耐药的例数，在异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星分别为5、5、3 例，合计13 例。荧光PCR熔解曲线法DST 耐药而表型DST 敏感的例数，在异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星分别为9、16、24 例，合计49 例。见表1。

表1 荧光PCR 熔解曲线法DST 与表型DST 对抗结核药物的药敏结果比较（例）

2.2 荧光PCR 熔解曲线DST 对抗结核药物异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星耐药性的诊断效能

以表型DST 为金标准，荧光PCR 熔解曲线DST对抗结核药物耐药性的诊断效能见表2。两种方法的总体不一致率，在异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星分别为8.24%、12.35%、15.88%[总体不一致率（%）=（假阳性例数+假阴性例数）/（真阳性例数+假阳性例数+真阴性例数+假阴性例数）×100%=1-总符合率（%）]。

表2 荧光PCR 熔解曲线DST 对抗结核药异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星耐药性的诊断效能

2.3 左氧氟沙星和莫西沙星的耐药性在表型DST 中比较

根据表型药物敏感性试验，170 例结核菌株，有29 例对左氧氟沙星耐药，耐药率为17.06%。5 例对莫西沙星耐药耐药，耐药率为2.94%。莫西沙星对结核杆菌的耐药率明显低于左氧氟沙星（χ2=18.823，P ＜0.01）。见表3。

表3 左氧氟沙星和莫西沙星的耐药性在表型DST 中比较（例）

3 讨论

近年来，分子DST 因其操作简单，检测时间短等特点，日益受到临床医师的认可[11]。作为分子DST 中的代表，荧光PCR 熔解曲线法在抗结核药物的耐药性检测中，应用逐渐增多；但荧光PCR 熔解曲线法的诊断效能，仍需进一步研究。本研究通过ROC 曲线的AUC 及Kappa 一致性分析及计算敏感性、特异性、符合率等指标，对我院同时具有表型DST 和荧光PCR 熔解曲线法DST 检测结果的170 例患者进行了分析。结果发现，以表型DST 为金标准，荧光PCR 熔解曲线法DST 对异烟肼的Kappa 值为0.821，AUC 为0.917，荧光PCR 熔解曲线法DST 对异烟肼耐药性的诊断具有良好的一致性，诊断价值较高，这与刘艳等[12]、曹志华等[13]、刘春平等[14]的研究结果类似。荧光PCR 熔解曲线法DST 对乙胺丁醇耐药性的诊断效能不如异烟肼，具有中等的诊断价值，中等的一致性，这与国内曹志华等[13]、李爱芳等[15]的研究结果类似。乙胺丁醇的耐药基因型（荧光PCR 熔解曲线法）和耐药表型之间的一致性偏低[16]，提示仍要加强对乙胺丁醇耐药机制的研究，对试剂盒增加更多的耐药基因检测位点。

喹诺酮类药物，包括左氧氟沙星、莫西沙星等，在结核病特别是耐药结核病的治疗中，应用非常广泛。由于喹诺酮类药物熔解曲线试剂盒无法区分左氧氟沙星及莫西沙星耐药，这对本研究结果的评价，不可避免地造成影响。为了研究荧光PCR 熔解曲线DST对左氧氟沙星耐药性的诊断效能，本研究选取左氧氟沙星的表型DST 结果与喹诺酮的荧光PCR 熔解曲线法DST 结果作比较（详见表2 的左氧氟沙星部分），发现荧光PCR熔解曲线法DST 对左氧氟沙星的诊断具有中等的一致性（Kappa 值为0.564），诊断价值中等（AUC 为0.863）。但同时看两种DST 的总体符合率，仅为84.12%。并且，本研究中，表型DST 中，莫西沙星的耐药率（2.94%）明显低于左氧氟沙星（17.06%）（P ＜0.01）。29 例对左氧氟沙星耐药的菌株中，仅有3 例同时对莫西沙星耐药，其余26 例对莫西沙星敏感。所以，在救治疑难重症结核患者的早期，即使当喹诺酮类药物熔解曲线判定结果为耐药时，在临床上仍可考虑合理使用莫西沙星。在未来的研究中，需要加强对喹诺酮类药物耐药机制的研究，进一步区分左氧氟沙星及莫西沙星的耐药基因位点，为临床诊治提供更多依据。

针对荧光PCR 熔解曲线法DST 和表型DST 检验结果存在不一致的问题，需要分析结果不一致的原因。这需要将结果不一致的情况分以下两类来解读。

（一）荧光PCR 熔解曲线法DST 敏感而表型DST耐药。这种情况在本研究中合计13 例。这其中可能的原因是：①本实验荧光PCR 熔解曲线试剂盒未包括所有已知的耐药基因突变位点，比如，基因embC 突变也可导致治结核药耐药[16]，但此种试剂盒的检测位点并不包括基因embC 基因。②仍有未知的耐药基因位点。③其他耐药机制引起的耐药，如：结核菌细胞壁渗透性障碍；结核菌表达药物外排泵以排出抗结核药物等；结核菌中的双组分系统[17]。

（二）荧光PCR 熔解曲线法DST 耐药而表型DST敏感。这种情况在本研究中合计49 例。这其中可能的原因是：①结核菌基因发生了同义突变[18-19]，即基因片段中某个碱基对的突变并没有引起相应氨基酸的改变，从而不会影响其所翻译的蛋白质的结构和功能。基因发生同义突变的结核菌，其对抗结核药的敏感性并不会改变，从而导致两种DST 检测结果的不一致。②异质性耐药，就是同一检测样本（如痰）中，同时存在基因型敏感和基因型耐药的菌株。结核杆菌的异质性耐药现象，在国内外的研究中均有报道[20-22]。因为异质性耐药也可能是结核菌群从部分耐药向完全耐药转变的一个过程[23]，所以，当熔解曲线出现“假阴性”、两种耐药性检测结果不一致时，需要警惕异质性耐药的可能性，定期复查荧光PCR 熔解曲线法DST和表型DST，及时调整抗结核方案。

荧光PCR 熔解曲线法DST 能够对常见的抗结核药物都做出检测，具有高通量、检测时间短（2～3 h）、实验室污染风险小的优点。同时，熔解曲线法DST 与传统的表型DST 比较，还更具成本-效益[24]。在实际工作中，应用荧光PCR 熔解曲线法可以及时为临床制订抗结核方案提供依据[25-26]，这有助于改善结核病的治疗延迟，减少耐药结核病的传播。同时，还需应用表型DST 等传统方法，对荧光PCR 熔解曲线法DST 的结果进行修正。

总之，荧光PCR 溶解曲线法对异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星的耐药性有较好的辅助诊断价值，值得进一步推广。荧光PCR 溶解曲线法与传统的表型DST应结合应用，互为补充，共同助力耐药结核病的诊疗。