祛风通络方对高糖诱导人肾小球系膜细胞炎症反应的影响

苏冠旬 李丽娜 陈 宇 赵博旭 张耀夫 赵进喜 黄为钧 王世东

1.北京中医药大学东直门医院肾病内分泌二科，北京 100010；2.北京中医药大学中医学院，北京 100029

糖尿病肾病（diabetic nephropathies，DN）是糖尿病常见的微血管并发症之一，是导致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。DN 发病机制复杂，其中免疫炎症损伤一直是DN 发病机制的研究热点。研究表明，p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activation protein kinase，p38 MAPK）通路是肾脏免疫炎症的重要途径，在炎症、纤维化和应激反应中都具有着重要作用[2-6]，其可以促进肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、细胞间黏附分子-1（intercelluar adhesion molecule-1，ICAM-1）等细胞因子表达，从而加剧DN 的恶化，而ICAM-1、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 等因子表达的增强能反作用于p38 MAPK 信号通路，促进通路的激活，加快肾纤维化的进展[7-10]。本课题组既往研究发现，祛风通络方（牛蒡子、蚕砂、穿山龙）在治疗DN 方面具有一定的效果，可降低尿蛋白、延缓肾小球纤维化，其机制与下调TGF-β1、MCP-1 等炎症因子的表达有关[11-13]。为进一步从分子生物学角度揭示祛风通络方治疗DN 的机制及“从风论治”法治疗DN 的合理性，本研究对祛风通络方改善高糖诱导人肾小球系膜细胞炎症反应的分子机制进行了分析。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株

人肾小球系膜细胞株，购自北京裕恒丰科技有限公司（货号：4200），传至第三代用于实验。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 高糖DMEM 培养液（25 mmol/L 葡萄糖）（美国Hyclone 公司，批号：NVL0337）；低糖DMEM培养液（美国Hyclone 公司）；胎牛血清（美国Gibco 公司，批号：10099-141）；TNF-α、TGF-β1、IL-1β、IL-6酶联免疫吸附试验试剂盒（美国Invitrogen 公司，批号：88-7346、88-8350、88-7261、88-7066）；ICAM-1抗体（美国Proteintech 公司，货号：10020-1-AP），p38 MAPK 抗体（美国CST 公司，货号：3690），β-actin 抗体、MCP-1 抗体、HRP 标记羊抗鼠、羊抗兔IgG（美国Abcam 公司，货号：ab9669、ab6276、ab6789、ab6721）；p38 MAPK 通路抑制剂SB203580（上海陶素公司，批号：152121-47-6）。

1.2.2 主要仪器 双垂直电泳槽（品牌：CAVOY；型号：MP-8001）；转移槽（品牌：CAVOY；型号：MP-3030）；温控摇床（品牌：其林贝尔；型号：TS-2000A）；电泳仪（品牌：CAVOY；型号：PP-1150）；荧光定量PCR 仪（厂家：Bioer Technology；仪器型号：Line Gene 9600 Plus）。

1.3 实验方法

1.3.1 血清制备 SPF 级Wistar 雄性大鼠，体重290～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002。实验动物伦理号：BUCM-4-2021060901-2049。实验动物饲养于北京中医药大学动物饲养室，室温18～22℃，湿度40%～60%，自然光照，喂标准颗粒饲料，自由饮水，适应性饲养并观察1 周，然后运用随机数字表法将其分为两组。一组予祛风通络方47.2 g/（kg·d）灌胃，另一组灌服同体积的生理盐水，2 次/d，连续3 d。末次灌胃2 h 后，麻醉后在大鼠股动脉进行无菌采血。将采集到的血液在4℃下静置4 h，在3000 r/min（离心半径8.5 cm）条件下离心20 min，分离血清，56℃水浴中灭活30 min，过滤除菌，-20℃保存。祛风通络方（组成：牛蒡子、蚕砂、穿山龙）颗粒剂，由北京中医药大学东直门医院药剂科提供。

1.3.2 细胞培养及分组 将人肾小球系膜细胞接种于含有10%胎牛血清（FBS）的低糖DMEM 培养基中，存放于37℃、5%CO2培养箱中培养，之后分别对各组进行处理：正常组（低糖DMEM 培养液+正常大鼠血清）、模型组（高糖DMEM 培养液+正常大鼠血清）、抑制剂组（高糖DMEM 培养液+正常大鼠血清+5 μmol/L SB203580 预处理）、祛风通络组（高糖DMEM 培养液+服用祛风通络方的大鼠血清）。

1.4 检测指标

1.4.1 酶联免疫吸附试验检测IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 的表达水平 取生长良好四组细胞，以5×105个/孔密度接种于6 孔板，培养24 h 后收集细胞上清液，依据IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 试剂盒说明书进行测定。每组6 个复孔。

1.4.2 Western blot 检 测ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK 的表达水平 四组培养48 h 后收集并提取细胞蛋白，按常规方法进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育，然后显色、拍照。上述过程重复3 次。结果采用Quantity One v.4.6.2 软件分析相对灰度值，并进行统计。

1.4.3 RT-PCR 检测IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK 的mRNA 表达水平 取生长良好四组细胞，培养48 h 后收集，提取RNA，用cDNA Synthesis Kit 试剂盒进行反转录，按照说明依次加入各组分。引物由北京基谱生物科技有限公司提供，序列及长度见表1。将反应体系进行95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，共45 个循环，分别测定待测样本目的基因及内参的Ct 值，按照2-ΔΔCt相对定量的计算公式，计算各组基因表达水平量的差异。

表1 引物序列及产物大小

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平比较

模型组IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平高于正常组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。祛风通络组IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 四组IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平比较（pg/ml，，n=6）

表2 四组IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 水平比较（pg/ml，，n=6）

注 与正常组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。IL：白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；TGF-β1：转化生长因子-β1

2.2 四组p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 水平比较

模型组p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 高于正常组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。祛风通络组p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1、表3。

表3 四组p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 水平比较（，n=3）

表3 四组p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 水平比较（，n=3）

注 与正常组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。p38 MAPK：p38 丝裂原活化蛋白激酶；ICAM-1：细胞间黏附分子-1；MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1

2.3 四组IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 的mRNA 表达水平比较

模型组IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 的mRNA 表达水平高于正常组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。祛风通络组IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 的mRNA表达水平低于模型组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。见图2～3。

3 讨论

本研究基于《黄帝内经》理论，对于DN 提出了“肾络伏风”病机学说，认为消渴病日久，热伤气阴，久病及肾，肾络亏虚，外风与内风乘虚侵袭人体，伏于肾之络脉，形成“肾络伏风”，治疗当重视祛风通络法，临床常使用各类“风药”，如牛蒡子、穿山龙、蚕砂等，取得了良好的效果[14-17]。

炎症信号通路受复杂的网络调控，p38 MAPK 是其中重要的调节机制之一，可使炎症反应形成恶性循环。IL-1β、IL-6、TGF-β1 参与了肾小球系膜细胞的异常增殖和细胞外基质的过度沉积[18-21]，而TNF-α 与DN 的肾肥大及超滤密切相关，是造成DN 蛋白尿发生的重要因子之一[22]。MCP-1 是导致DN 慢性炎症反应的重要原因之一，其可通过激活及趋化单核/巨噬细胞，释放多种炎症介质如IL-6、ICAM-1 等，刺激肾小球毛细血管基膜变厚、肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质生成增多，从而加快肾小球的硬化[23-24]。在DN 中，高表达的ICAM-1 可促使单核细胞向肾脏游走，引发单核细胞、淋巴细胞与血管内皮细胞之间的黏附，使炎症细胞在肾脏浸润，产生细胞因子，加重内皮细胞损伤[25]。

本研究结果显示，在高糖诱导后，人肾小球系膜细胞中的IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1 表达升高，p38 MAPK 信号通路激活。祛风通络方含药血清干预后，可明显减轻高糖诱导的人肾小球系膜细胞的炎症反应，并且可以抑制p38 MAPK 信号通路的激活，提示祛风通络方可能通过抑制p38 MAPK 信号通路，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1 的表达，从而发挥抗炎作用。

综上，本研究显示祛风通络方可以降低高糖诱导人肾小球系膜细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1 的表达，从而减轻炎症反应，其机制与p38 MAPK 信号通路相关。