冠心病患者血清长链非编码RNA H19和微小RNA-22表达水平及其临床意义研究

高珩，李媛媛，郭锋伟，王雪

冠心病（coronary heart disease，CHD）主要由沉积在血管中的脂质形成粥状白色斑块引起［1］。随着血管中脂质沉积量的增加，血液循环受阻，进而导致心脏缺血［2］。据报道，我国CHD患者每年的死亡率约为0.11%，是影响公民健康的重要危险因素［3］。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是两类非编码RNA，是细胞转录水平及转录后水平的调控因子，研究表明lncRNA和miRNA在心血管疾病的发生发展及诊断治疗中具有重要作用［4-5］。另外，炎性反应也是导致冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的原因，是CHD发生的重要机制［6］。实验证实，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、内皮素1（endothelin 1，ET-1）、白介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）以及超敏C反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）与CHD的发生密切相关［7］。本研究旨在探究lncRNA H19和miR-22在CHD患者血清中的表达水平及其对CHD的诊断价值、与炎性因子水平的相关性，以期为临床CHD的诊断和治疗提供一定理论支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年6月至2021年6月在陕西省人民医院就诊的CHD患者113例作为试验组，并选择同期于本院体检的健康志愿者88例作为对照组。试验组纳入标准：（1）符合第8版《内科学》［8］中CHD的诊断标准，且造影显示至少1支冠状动脉狭窄≥50%；（2）临床资料完整；（3）年龄35～75岁。排除标准：（1）合并恶性肿瘤者；（2）近3个月内有外科手术史或创伤史者；（3）严重肝肾功能障碍者；（4）合并严重自身免疫性疾病，或服用免疫抑制剂者；（5）合并血液传染性疾病或近期有中重度感染者。对照组纳入标准：（1）年龄35～75岁；（2）无心力衰竭、CHD、先天性心脏病、大动脉炎等心血管相关疾病。排除标准：（1）严重肝肾功能障碍者；（2）合并恶性肿瘤或不能控制的高血压者；（3）有严重脑栓塞、脑出血病史者；（4）合并自身免疫性疾病或近半年服用免疫抑制剂者；（5）合并中重度血液传染性疾病者。试验组中男62例，女51例；年龄35～75岁，平均（54.6±8.8）岁。对照组中男45例，女43例；年龄35～73岁，平均（53.2±7.4）岁。两组受试者性别（χ2=0.277，P=0.599）、年龄（t=1.021，P=0.076）比较，差异无统计学意义。本研究经陕西省人民医院伦理委员会批准同意，受试者均对本研究知情同意。

1.2 RT-PCR检测受试者血清lncRNA H19、miR-22表达水平 采集受试者清晨空腹外周血5 ml，3 000 r/min离心15 min（离心半径为10 cm），取血清；采用RNA提取试剂盒（GenEluteTM，Sigma）提取血清总RNA；采用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测RNA浓度和纯度，检测合格后取1 g 总RNA反转录为cDNA〔InRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒，KR202-01；miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒，KR211；天根生化科技（北京）有限公司〕；采用RT-PCR检测lncRNA H19、miR-22表达水平，严格按照Quant SYBR Green PCR试剂盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕操作；引物序列见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，分别以β-actin和U6为内参。PCR条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个实验设置3个复孔，反应结束后采用2-ΔΔCt法计算lncRNA H19、miR-22表达水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 ELISA法检测血清炎性因子、内皮功能指标水平 采用ELISA检测血清炎性因子、内皮功能指标水平，前者包括IL-6、TNF-α、hs-CRP，后者包括VEGF、ET-1，严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件进行数据处理和分析。符合正态分布的计量资料以（x± s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；采用ROC曲线评估血清lncRNA H19、miR-22表达水平及其联合诊断CHD的价值；两变量间的相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者血清lncRNA H19、miR-22表达水平比较 试验组患者血清lncRNA H19、miR-22表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组受试者血清lncRNA H19、miR-22表达水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum expression level of lncRNA H19 and miR-22 between the two groups

表2 两组受试者血清lncRNA H19、miR-22表达水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum expression level of lncRNA H19 and miR-22 between the two groups

组别 例数 lncRNA H19 miR-22对照组 88 1.14±0.40 1.05±0.28试验组 113 1.87±0.44 1.59±0.43 t值 -9.871 -10.529 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 两组受试者血清炎性因子、内皮功能指标水平比较 试验组患者血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组受试者血清炎性因子水平、内皮功能指标水平比较（±s）Table 3 Comparison of serum levels of inflammatory factors and endothelial function indexes between the two groups

表3 两组受试者血清炎性因子水平、内皮功能指标水平比较（±s）Table 3 Comparison of serum levels of inflammatory factors and endothelial function indexes between the two groups

注：IL-6=白介素6，TNF-α=肿瘤坏死因子α，hs-CRP=超敏C反应蛋白，VEGF=血管内皮生长因子，ET-1=内皮素1

E T-1（n g/L）对照组 8 8 3 8.8±1 3.5 1 1.8±4.7 6.5±1.7 9 5.8±3 5.3 4 7.9±1 0.6试验组 1 1 3 1 3 2.5 ±1 6.8 3 7.6±5.4 1 9.4±5.6 5 3 5.6±9 3.8 1 0 9.0±2 3.6 t值 1 2.5 5 7 1 2.7 4 8 8.6 3 2 1 5.3 5 9 1 0.8 6 5 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1组别 例数 I L-6（n g/L）T N F-α（n g/L）h s-C R P（m g/L）V E G F（n g/L）

2.3 血清lncRNA H19、miR-2表达水平及其联合诊断CHD的价值 ROC曲线分析结果显示，血清lncRNA H19、miR-22表达水平及其联合诊断CHD的AUC分别为0.827〔95%CI（0.770，0.884）〕、0.817〔95%CI（0.758，0.876）〕、0.894〔95%CI（0.850，0.938）〕，最佳截断值分别为1.44、1.39、0.64，灵敏度分别为78.1%、65.8%、76.3%，特异度分别为79.4%、85.2%、89.8%，Youden指数分别为0.565、0.510、0.661，见图1。

图1 血清lncRNA H19、miR-22表达水平及其联合诊断CHD的ROC曲线Figure 1 ROC curve of serum expression level of lncRNA H19, miR-22 and their combination for the diagnosis of CHD

2.4 CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表达水平与炎性因子、内皮功能指标水平的相关性分析 CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表达水平与IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平均呈正相关（P＜0.05），见表4。

表4 CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表达水平与炎性因子、内皮功能指标水平的相关性Table 4 Correlation between serum expression level of lncRNA H19,miR-22 and levels of inflammatory factors, endothelial function indexes in CHD patients

3 讨论

CHD是严重影响人类健康的重要疾病之一，近年来其发病率逐渐上升，且发病年龄越来越年轻化。世界上80%以上的心脏猝死是由CHD引起的，其余病例是由其他疾病引起的，包括心肌病、先天性心脏病、左心室肥厚、主动脉瓣疾病和其他心脏病［9］。目前CHD的诊断和治疗已取得较大的进步，但每年CHD的发病率及死亡率仍不容忽视［10］。所以，CHD的早期预防和诊断对于降低其病死率尤为重要。

lncRNA是一类长度为200 nt的非编码RNA，其可在转录或转录后调控细胞分化、增殖、自噬等过程。既往研究表明，lncRNA与心血管疾病有关［11-13］。同样，miRNA是一类包含约22个核苷酸的内源性非编码RNA，其通过诱导mRNA降解或阻断翻译来转录和控制基因表达，与各类疾病（包括心血管疾病）的发生有关［14-15］。本研究结果显示，试验组患者血清lncRNA H19、miR-22表达水平高于对照组，提示CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表达水平升高。且血清lncRNA H19、miR-22表达水平及其联合诊断CHD的AUC分别为0.827、0.817、0.894，最佳截断值分别为1.44、1.39、0.64，灵敏度分别为78.1%、65.8%、76.3%，特异度分别为79.4%、85.2%、89.8%，Youden指数分别为0.565、0.510、0.661，表明血清lncRNA H19表达水平联合血清miR-22表达水平对CHD的诊断价值更高。仉慧颖等［16］研究发现，CHD患者血清lncRNA H19表达水平升高，且其对CHD的发生有明显的促进作用，本研究结果与之相似。有研究发现，与完全无动脉粥样硬化的急性心肌梗死组织相比，冠状动脉粥样硬化斑块中，miR-22表达水平明显升高［17］。所以lncRNA H19和miR-22在CHD的发生中有重要作用。

ZHANG等［5］进一步探究lncRNA对CHD的调控机制发现，lncRNA ANRIL可作为促进WDR5和HDAC3结合形成WDR5和HDAC3复合物的分子支架，其通过上调活性氧水平，促进人主动脉平滑肌细胞表型转化。还有研究表明，lncRNA MALAT1在CHD患者血清和内皮祖细胞中过度表达，并且其可通过调控miR-15b-5p/MAPK信号轴和mTOR信号通路来抑制内皮祖细胞自噬，提高细胞活力，同时抑制心肌细胞凋亡［18］。lncRNA可以作为miRNA的“分子海绵”，进而形成竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络，影响细胞生物学行为；或直接通过介导细胞信号通路，或通过表观遗传学而影响生物学过程［19-20］。以上研究表明，lncRNA、miRNA在CHD的发生中有非常重要的意义，且不同的lncRNA和miRNA在CHD的发生中作用不同。后续实验需要进一步从细胞生物学层面探究lncRNA H19和miR-22对CHD发生的调控机制。

CHD的发病机制过于复杂，但通常为动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）引起的管腔狭窄或闭塞，从而阻碍正常血液循环。研究表明，炎性反应在AS的发生和发展中起着重要作用。血管炎性反应可改变血管壁的形状，引发血栓形成，并促进AS斑块从稳定状态转变为脆弱状态，从而诱发栓塞并引发各种心脑血管疾病［21］。有研究表明，lncRNA、miRNA与CHD患者血清炎性因子水平有一定相关性［22］。刘俊逸等［23］研究表明，LncRNA TUG1与血清炎性因子IL-6水平呈正相关。本研究结果显示，试验组患者血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平高于对照组，且CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表达水平与IL-6、TNF-α、hs-CRP、VEGF、ET-1水平均呈正相关，提示lncRNA H19和miR-22可通过调控炎性因子、内皮功能指标水平而影响CHD的发展。

综上所述，CHD患者血清lncRNA H19、miR-22表达水平升高，其对CHD有一定诊断价值，且二者联合的诊断价值更大；此外，其与血清炎性因子、内皮功能指标水平均呈正相关。但本研究未探讨血清lncRNA H19、miR-22表达水平与CHD患者疾病严重程度及预后的相关性，在后期可通过随访数据进一步研究。

作者贡献：高珩进行文章的构思与设计，撰写论文，进行统计学处理并对文章整体负责、监督管理；王雪进行研究的实施与可行性分析、论文修订；高珩、李媛媛进行资料收集；郭锋伟进行资料整理；高珩、王雪负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。