丹栀逍遥散对D-氨基半乳糖/脂多糖诱导的大鼠急性肝损伤保护作用机制研究*

刘尚智，张志强，李昇锦

急性肝损伤(ALI)病情进展快且病情极为凶险，诊治不及时将严重影响肝脏的解毒、合成和转化等功能，甚至进展为肝功能衰竭，危及患者的生命健康[1，2]。药物滥用是引发肝病的重要原因之一，然而目前临床上尚缺乏明确的肝功能保护和促进肝细胞再生的特效方案。近期有文献研究证实丹栀逍遥散在肝功能保护方面具有一定的效果。丹栀逍遥散又被称为八味逍遥散或加味逍遥散，药理学研究证实其具有疏肝健脾和清热活血的功效，尤其适用于肝郁血虚生热症患者，目前在临床各科疾病治疗上被广泛应用[3，4]。脂多糖(LPS)属于内毒素中的一种，其可诱导氧化应激反应和全身炎症反应，易致急性肝损伤，而D-氨基半乳糖(D-GaIN)属于特异性肝损伤药物，研究证实其可耗竭肝细胞内三磷酸尿嘧啶核苷，同时抑制RNA的合成及其蛋白质表达。此外，D-GaIN可促进肠道对内毒素的吸收，增强LPS的肝脏毒性[5，6]。本研究采用D-GaIN/LPS诱导急性肝损伤大鼠模型，观察了丹栀逍遥散的保护作用及其可能的作用机制，有望为ALI的有效治疗提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物与试剂 由上海斯莱克生物有限公司提供的健康雄性SD大鼠110只，体质量为180～200 g(合格证号：2012001606577)。购于安徽老百姓大药房的丹栀逍遥散由牡丹皮、栀子、当归和芍药等中药组成，将药片煎成汤汁、浓缩备用，生药浓度为2 g/mL，实验前用蒸馏水配成所需浓度，用于给大鼠灌胃。上海生工生物有限公司提供的D-GaIN(批号：A600474)，美国Sigma公司生产的LPS(批号：L4130)，美国R&D公司提供的ELISA试剂盒(批号：VAL609)，中生北控生物科技股份有限公司生产的检测血生化指标试剂(批号：20120819)，南京建成生物工程研究所提供的检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX，批号：20121222)试剂盒，上海生工生物有限公司提供的检测白介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α，批号：20120915)试剂盒和透明质酸酶(HA)、层黏连蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原(Ⅲ-PC，批号：20110723)。其余试剂均属于国产分析纯试剂。

1.2 ALI模型的制备 随机将110只大鼠分为对照组、模型组、小剂量、中剂量和大剂量中药干预组，每组22只。给予大鼠D-GaIN 700 mg.kg-1和LPS 1 mg.kg-1腹腔注射，建立ALI模型，给予对照组大鼠等体积磷酸盐缓冲液(PBS)腹腔注射。在建模成功后15 min，分别给予丹栀逍遥散3.83 g.kg-1、7.66 g.kg-1和15.33 g.kg-1(灌药体积为10 mL/kg)灌胃，而在模型组和对照组，则给予等体积生理盐水灌胃。所有大鼠持续灌胃7 d，1次/d。

1.3 观察指标 在实验结束时，处死大鼠，取肝组织，固定于甲醛溶液中，行病理学检查。经腹主动脉取血，采用ELISA法检测血清MDA、SOD和GSH-PX和IL-6、IL-β和TNF-α水平；采用放射免疫分析法检测血清肝纤维化指标。

2 结果

2.1 各组肝组织病理学表现 模型组肝组织细胞排列不规律，存在大量的血管破裂和红细胞弥散，细胞形态异常；经小剂量、中剂量和大剂量丹栀逍遥散干预后，随着药物剂量的增加，肝组织病变程度逐渐减轻(图1)。

2.2 各组大鼠肝功能指标比较 模型组血清总胆红素和转氨酶水平显著高于对照组(P<0.05)，而各剂量药物干预组血清AST、ALT、TBIL水平显著低于模型组(P<0.05，表1)。

2.3 各组血清氧化应激反应指标比较 模型组血清MDA水平显著高于，而血清SOD和GSH-PX水平显著低于对照组(P<0.05)；各剂量药物干预组血清MDA水平显著低于，而血清SOD和GSH-PX水平显著高于模型组(P<0.05，表2)。

2.4 各组血清细胞因子水平比较 模型组血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著高于对照组(P<0.05)，而各剂量药物干预组血清细胞因子水平显著低于模型组(P<0.05，表3)。

2.5 各组血清肝纤维化指标比较 模型组血清HA、LN、Ⅲ-PC显著高于对照组(P<0.05)，而各剂量药物干预组血清HA、LN、Ⅲ-PC水平显著低于模型组(P<0.05，表4)。

图1 各组肝组织病理学表现(HE，200×)A：对照组；B：模型组；C：小剂量干预组；D中剂量干预组；E：大剂量干预组

表1 各组大鼠肝功能指标比较

表2 各组血清氧化应激反应指标比较

表3 各组血清细胞因子水平比较

表4 各组血清肝纤维化指标比较

3 讨论

本研究结果显示，ALI模型制备成功，经中药干预后，动物血清AST、ALT、TBIL水平降低，提示丹栀逍遥散可有效减轻肝脏损害，对大鼠肝功能有一定的保护作用，与相关研究报道基本相符[7-10]。

本实验结果还显示模型组血清MDA、IL-6、IL-β、TNF-α、HA、LN、Ⅲ-PC均呈显著升高，经小剂量、中剂量和大剂量中药干预后，血清细胞因子和氧化应激指标降低。早期相关研究表明D-GaIN/LPS对肝脏损伤主要通过肝细胞内尿苷二磷酸途径，继而影响肝细胞能量代谢和蛋白质合成，在增加细胞内钙离子浓度的同时，导致谷胱苷苷肽耗竭和TNF-α释放，继而引起细胞凋亡[11，12]。IL-6、IL-1β、TNF-α为常见的炎症介质，通过促进炎症细胞聚集活化和炎症介质的释放，引起内皮细胞功能失调和炎症症状加重。IL-1β主要通过激活内皮细胞继而诱导细胞间黏附分子表达，与TNF-α相互促进，而IL-6参与多种生物学效应，是介导炎症反应发生的重要因素[13，14]。当机体处于氧化应激状态时，MDA、SOD、GSH-PX将异常表达，SOD可抑制自由基启动的脂质过氧化反应，在机体抗氧化方面发挥重要作用，其水平高低间接预示机体清除自由基的能力[15]。MDA为脂质过氧化反应的产物之一，可严重破坏细胞膜结构并导致细胞肿胀坏死，而GSH-PX则可有效保护细胞膜结构和功能的完整性[16]。本研究结果初步提示ALI大鼠存在明显的氧化应激反应和炎症反应，推测肝功能损伤和纤维化状态或与机体氧化应激反应和炎症反应密切相关。本研究结果同样证实，随着丹栀逍遥散用药剂量的加大，对氧化应激反应、炎症反应和肝纤维化的改善作用更明显。丹栀逍遥散主要由柴胡、牡丹皮、炒山栀、芍药、茯苓、当归、炒白术和炙甘草组成，方中柴胡有疏肝解郁作用，牡丹皮可清火，炒山栀则由清肝热的功效，而当归养血和血，白芍养血敛阴、柔肝缓急，茯苓、白术、甘草则益气健脾，全方诸药联用共奏疏肝清热和养血健脾之功[17，18]。现代药理学研究证实柴胡对大鼠肝功能存在明显的保护作用，同时可有效改善大鼠肝纤维化程度。牡丹皮和栀子等均被证实存在明显的肝功能保护作用[19，20]。