意大利蝗海藻糖酶基因克隆及卵低温驯化下的表达模式

刘 倩, 罗 迪, Roman JASHENKO, 季 荣,*

(1. 新疆师范大学生命科学学院, 中亚区域跨境有害生物联合控制国际研究中心,新疆特殊环境物种保护与调控生物学自治区重点实验室, 新疆特殊环境物种多样性应用与调控教育厅重点实验室,乌鲁木齐 830054; 2. 哈萨克斯坦阿勒法拉比国立大学, 阿拉木图 050038)

海藻糖作为二糖类碳水化合物不仅可以在各种环境胁迫条件下保护蛋白和细胞分子结构，抵抗不良环境(Tangetal., 2008)，还可作为能量物质和碳源参与生物体的代谢过程(Argüelles, 2000)。海藻糖酶是昆虫体内唯一水解海藻糖的酶，将海藻糖水解形成葡萄糖为昆虫的生长发育提供能量(唐斌等, 2012)，海藻糖酶可分为可溶型海藻糖酶(TreS或Tre1)和膜结合型海藻糖酶(TreM或Tre2)，前者主要存在于消化系统和循环系统，后者主要存在于肌肉中，飞行类昆虫体内的TreM活性相对较高(Derr and Randall, 1966)。海藻糖酶是由海藻糖酶基因(Treh)编码，最先从昆虫中克隆出的海藻糖酶基因是可溶型海藻糖酶基因Treh1(Takiguchietal., 1992)，2005年膜结合型海藻糖酶基因在家蚕Bombyxmori中被发现并成功克隆(Mitsumasuetal., 2005)，随后在多种昆虫体内都发现了两种海藻糖酶基因(田宇等, 2016; 王德意等, 2018)。研究表明，海藻糖酶是昆虫体内调节滞育激素和保幼激素及几丁质合成途径中的关键酶(Ogiso and Takahashi, 1984; Kameietal., 2011; Shuklaetal., 2016)，海藻糖酶基因受到干扰后不仅会阻断有机体能量代谢，还会影响昆虫正常的生长发育(Chenetal., 2010)，张倩等(2012)利用RNAi技术干扰海藻糖酶基因后，几丁质合成受到影响，致使昆虫生长发育受阻，死亡率增加。

昆虫属于变温动物，极端低温或高温都会影响昆虫生存和生长发育(Boaedmanetal., 2015; Maetal., 2021)，低温驯化(cold acclimation)可显著提高昆虫在低温下的存活率(Lee, 1989)。将绿盲蝽Apolyguslucorum越冬卵经过0℃下40 min处理后，其在-20℃下的死亡率显著降低(卓德干等, 2012)；其次，低温驯化可通过调节相关耐寒基因的表达提高昆虫的抗寒能力(Fuetal., 2020)。一定范围内温度越低亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis越冬滞育幼虫AK,Tpi和Gst基因表达量越高(刘宁, 2017)。在低温胁迫处理下，假眼小绿叶蝉Empoascavitis的Tre2表达量增加(汪晓茜, 2018)。异色瓢虫Harmoniaaxyridis经过不同低温处理后，Trehl-1基因表达量显著增加，说明昆虫在受到低温胁迫时，会通过调动海藻糖的利用和加强海藻糖的代谢等方式进行御寒(秦资, 2012)。

意大利蝗Calliptamusitalicus是新疆草原的重要害虫(张泉等, 1995)，以滞育卵在土壤中越冬，越冬卵发育经历早期、滞育、滞育解除3个阶段(王香香等, 2019)。新疆冬季寒冷，倒春寒现象时有发生，蝗卵耐寒能力是其能否顺利越冬以维持种群数量的关键(葛婧等, 2014)，探讨越冬卵耐寒能力对害虫种群预报和防治具有重要意义。课题组前期研究发现，自然条件下，随着蝗卵发育进程，意大利蝗卵的血蓝蛋白基因Hc2表达呈现出先增加后减少的变化趋势，并在滞育阶段Hc2表达量最高(王香香等, 2019)。Hc2基因与氧气运载有关(Terwilliger, 1998)，氧气运载需要消耗能量，而能量供给则主要来自海藻糖酶分解海藻糖。基于此提出假设，低温胁迫下蝗卵海藻糖酶基因与Hc2的表达变化趋势相同，以满足蝗卵不同发育阶段的能量供给。本研究通过克隆海藻糖酶基因，进行生物信息学分析，对其在意大利蝗卵不同发育阶段低温驯化前后的表达谱进行测定，旨在进一步探讨蝗卵抵御冬季低温的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 试虫来源与处理

于2019年7月初赴新疆维吾尔自治区昌吉玛纳斯南山蝗区实验站(43°54′ N, 86°7′ E; 海拔1 310 m)捕捉意大利蝗雌、雄成虫，并混合饲养于室外的虫笼(1 m×1 m×1 m)中。笼内的地面上放置4个直径相同、深度为12 cm的塑料花盆，花盆里装满砂壤土，供意大利蝗产卵。笼内饲养密度为500头/m2以获得群居型意大利蝗(张洋, 2011)。每日饲喂新鲜冷蒿Artemisiafrigida、紫花苜蓿Medicagosativa直至交配产卵。每日定时更换花盆，并通过筛土法收集卵囊。

卵囊带回实验室后放在盛有蛭石的塑料盒(30 cm×20 cm×9.6 cm)中，深度约为5 cm，塑料盒用封口膜密封并扎有小孔以保湿和透气。预实验将不同发育阶段的蝗卵于0℃和4℃下分别处理5, 10和15 d。结果显示，0℃处理15 d后蝗卵早期(8月中旬-9月初)、滞育阶段(12月底-1月中旬)、滞育解除阶段(翌年3月底-5月初)3个发育阶段的过冷却点与对照组常温(27℃)有显著差异(P<0.05)，其他处理条件下无显著差异，故将0℃低温处理15 d的蝗卵作为实验组，以置于人工培养箱(RTOP-430B1, 浙江托普仪器有限公司)27℃(任金龙等, 2015b)、处于相同发育阶段的蝗卵作为对照组。两组同时在意大利蝗卵早期、滞育、滞育解除阶段分别取样，每组30粒卵，重复3组。意大利蝗越冬卵不同发育阶段划分采用王香香等(2019)方法，因产卵时间、当年的气温变化或存放蝗卵的温度不同，都会对意大利蝗卵发育时间造成影响(任金龙等, 2015a)，故本实验依据发育阶段进行实验而非发育时间。人工培养箱温度为27±1℃，相对湿度为45%±5%，光周期为14L∶10D(任金龙等, 2015b)。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

取1.1节不同发育阶段的实验组和对照组意大利蝗卵各100 mg，液氮研磨后，参照TRIzol试剂说明书进行总RNA提取。以1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取质量，采用超微量生物检测仪(NanoDrop2000, 美国Thermo公司)进行RNA浓度和纯度的测定。以提取的总RNA作为模板，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, 大连)操作说明合成cDNA的第1链，保存备用。

1.3 意大利蝗卵海藻糖酶基因片段扩增

从课题组前期注释的意大利蝗卵转录组数据中(未发表)获得意大利蝗卵海藻糖酶基因的序列信息，并在NCBI blast中进行比对。利用Primer Premier 6.0软件设计序列全长的扩增引物(表1)。以1.2节合成的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系(30 μL): cDNA模板1 μL，上下游引物(0.2 μmol/L)各1.5 μL, PCR Master Mix 15 μL及ddH2O 11 μL。PCR反应条件: 94℃预变性4 min; 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 30个循环；最后72℃延伸10 min; 4℃条件下保存。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用EZ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA的电泳后回收，将回收的目的片段与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞中转化，经蓝白斑筛选后，进行菌液PCR阳性克隆检测，选取检测合格的3个菌液样品送至上海生工进行测序。

1.4 意大利蝗卵海藻糖酶基因的生物信息学分析

利用NCBI中的ORF Finder(http:∥www. ncbi. nlm. nih. Gov/gorf/gorf. html)工具对获得的序列进行开放阅读框预测，并将其核苷酸序列翻译成氨基酸序列；用在线网站ProtParam (http:∥web. Expasy. org/protparam/)进行等电点、分子质量、氨基酸组成和理化性质预测；分别使用SignalP 4.1(http:∥www. cbs. dtu. dk/services/Si GnalP/)与TMHMM(http:∥www. Cbs. Dtu. dk/services/TMHMM/)进行信号肽和跨膜区的预测；通过在线分析工具PBIL(https:∥prabi. ibcp. fr/htm/site/web/home)和SWISS-MODEL(https:∥swissmodel. expasy. org)预测其二、三级结构。序列同源性比对采用在线Blast程序(https:∥blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)；用MEGA7.0中的邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树，重复运行1 000次。

1.5 意大利蝗卵海藻糖酶基因的表达谱分析

应用RT-qPCR技术分析意大利蝗卵不同发育阶段和低温驯化后的海藻糖酶基因mRNA的表达情况。以β-actin为内参基因，引物序列见表1，以1.2节合成的cDNA为模板，使用SYBR®Premix Ex TaqTMGreen Ⅱ试剂盒进行荧光实时定量PCR反应。反应体系(20 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(0.2 μmol/L)各1 μL, ddH2O 7 μL, SYBR Green Supermix 10 μL。反应程序: 95℃ 10 min; 95℃ 10 s, 58℃ 15 s, 72℃ 15 s, 40个循环; 95℃ 10 s, 65℃ 60 s, 97℃ 1 s。生成溶解曲线。每组蝗卵样品3次技术重复。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 数据分析

采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)计算分析对照组和实验组意大利蝗卵不同发育阶段海藻糖酶基因的相对表达量。采用SPSS方差分析(ANOVA)最小显著性差异法(LSD)进行多重比较检验，分析不同发育阶段蝗卵的基因表达量差异；低温驯化后蝗卵不同发育阶段海藻糖酶基因表达量与对照组(27℃)的差异采用独立样本T检验，显著性检验水平P<0.05。

2 结果

2.1 意大利蝗卵海藻糖酶基因的克隆与序列特征

克隆共获得4个具有完整开放阅读框(ORF)的海藻酶基因序列，依次命名为CiTreM1,CiTreM2,CiTreS1和CiTreS2(GenBank登录号分别为MZ669810, MZ669811, MZ669812和MZ669813)，其编码蛋白中CiTreM1和CiTreM2为膜结合型海藻糖酶，CiTreS1和CiTreS2为可溶型海藻糖酶。其中CiTreM1的ORF全长为1 797 bp，编码598个氨基酸，预测的蛋白分子质量为69.53 kD，理论等电点为5.30，包含83个带负电荷氨基酸残基，68个带正电荷氨基酸残基，无信号肽序列，有一段约为22个氨基酸的跨膜区，跨膜结构域的位置在第539-561位氨基酸；CiTreM2的ORF全长为1 797 bp，编码598个氨基酸，预测的蛋白分子质量为69.24 kD，理论等电点为5.02，包含82个带负电荷氨基酸残基，56个带正电荷氨基酸残基，具有长为18个氨基酸残基(MFHGSEVVLCIALVSIVS)的信号肽序列，有一段约为22个氨基酸的跨膜区，跨膜结构域的位置在第574-596位氨基酸；CiTreS1的ORF全长为1 653 bp，编码550个氨基酸，预测的蛋白分子质量为62.70 kD，理论等电点为5.68，包含65个带负电荷氨基酸残基，57个带正电荷氨基酸残基，无信号肽序列，无跨膜结构域；CiTreS2的ORF全长为1 194 bp，编码397个氨基酸，预测的蛋白分子质量为46.13 kD，理论等电点为8.10，包含46个带负电荷氨基酸残基，48个带正电荷氨基酸残基，无信号肽序列，无跨膜结构域。4个蛋白都具有2个海藻糖酶特有的标签序列“QWDFPNVWPP”和“PGGRFREFYYWDSY”和1个甘氨酸富集区“GGGGEY”(图1)。

图1 意大利蝗与飞蝗海藻糖酶的氨基酸序列比对Fig. 1 Multiple alignment of amino acid sequences of trehalase from Calliptamus italicus and Locusta migratoria飞蝗海藻糖酶蛋白序列的GenBank登录号GenBank accession numbers of trehalase proteins from L. migratoria: LmTre-M1: AQV08185.1; LmTre-M2: AQV08187.1; LmTre-S1: AQV08186.1; LmTre-S2: ACP28173.1. 海藻糖酶特有的序列标签“QWDYPNAWPP”和“PGGRFREFYYWDSY”用下划线表示，甘氨酸富集区“GGGGEY”用波浪线表示，相同的氨基酸残基以红色背景表示，相似的氨基酸残基以蓝色框表示。Typical sequence tags “QWDYPNAWPP”and“PGGRFREFYYWDSY”in trehalase proteins are underlined, glycine enrichment area “GGGGEY” is underlined with wavy lines, identical amino acid residues are indicated by a red background, and similar amino acid residues are indicated by a blue box.

2.2 预测的意大利蝗卵海藻糖酶基因编码蛋白二级和三级结构

CiTreM1, CiTreM2, CiTreS1和CiTreS2的二级结构均由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规卷曲组成，其中，α-螺旋占比最高，分别为45.15%, 48.16%, 45.27%和48.87%；β-转角占比最少，分别为4.85%, 4.68%, 5.27%和5.04%；延伸链和无规卷曲分别占10.70%和39.30%, 11.04%和36.12%, 11.64%和37.82%, 10.83%和35.26%。蛋白质的三级结构是α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等二级结构通过侧链基团的相互作用进一步卷曲、折叠，借助次级键的维系形成的。通过在线软件SWISS-MODE对意大利蝗卵海藻糖酶基因蛋白三级结构预测的结果显示，4个蛋白三级结构较为相似，都是主要由螺旋和卷曲构成，转角和线圈占比较少，α-螺旋包围着无规卷曲形成类似球形的蛋白质分子，二级结构预测与三级结构预测相吻合。

2.3 意大利蝗卵海藻糖酶基因的序列同源性和进化树

将克隆得到的意大利蝗卵海藻糖酶基因与其他昆虫的进行同源性分析，发现CiTreM1与飞蝗Locustamigratoria和蚜虫Siphaflava海藻糖酶氨基酸序列一致性分别达到88.98%和61.53%，CiTreM2与飞蝗和灰飞虱Laodelphaxstriatellus海藻糖酶氨基酸序列一致性分别为94.86%和67.01%；CiTreS1与飞蝗和人体虱Pediculushumanuscorporis的海藻糖酶氨基酸序列一致性分别为83.95%和54.26%，CiTreS2与东亚飞蝗L.m.manilensis和桃蚜Myzuspersicae的海藻糖酶氨基酸序列一致性分别为84.26%和54.43%。

系统发育树显示，CiTreM1和CiTreM2与其他昆虫膜结合型海藻糖酶聚为一支，与飞蝗的亲缘关系最近，与其他直翅目和半翅目昆虫膜结合型海藻糖酶的亲缘关系较近(图2)；CiTreS1和CiTreS2与其他昆虫可溶型海藻糖酶构成一个分支，与东亚飞蝗的亲缘关系最近，置信度为100%(图2)。

图2 邻接法构建的基于氨基酸序列的意大利蝗和其他物种海藻糖酶的系统进化树(1 000次重复)Fig. 2 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of trehalases from Calliptamus italicus andother species constructed by neighbor-joining method (1 000 replicates)

2.4 意大利蝗卵不同发育阶段海藻糖酶基因表达及低温驯化后表达量的变化

结果显示，常温27℃下意大利蝗卵3个发育阶段中CiTreM1,CiTreM2,CiTreS1和CiTreS2均有表达，但变化趋势不同(图3)。CiTreM1在滞育解除阶段表达水平最高，在滞育阶段表达水平最低，3个阶段的表达水平有显著差异(P<0.05)；CiTreM2在滞育阶段的表达水平最高，在滞育解除阶段表达水平最低，滞育阶段与早期和滞育解除阶段间的表达水平差异显著(P<0.05)。CiTreS1和CiTreS2均在早期阶段表达量最高，随后下降，CiTreS2整体表达水平低于CiTreS1表达水平(图3)。

图3 意大利蝗卵不同发育阶段海藻糖酶基因的相对表达量Fig. 3 Relative expression levels of CiTre genes in differentdevelopmental stages of Calliptamus italicus eggs图中数据为平均值±标准差，柱上不同字母表示基因表达量在不同发育阶段间差异显著(P<0.05，方差分析中的LSD检验)。Data in the figure are mean±SD. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages (P<0.05, LSD in ANOVA).

在卵发育的同一阶段，4个基因的表达量也明显不同，早期阶段表达量的高低顺序为CiTreS1>CiTreS2>CiTreM2>CiTreM1；滞育阶段为CiTreM2>CiTreS2>CiTreS1>CiTreM1；滞育解除阶段为CiTreM1>CiTreS1=CiTreM2=CiTreS2(图3)。

低温(0℃)驯化15 d后，与对照组(27℃)比较，CiTreM1表达量增加，且在早期阶段差异极显著(P<0.01)，在滞育阶段和滞育解除阶段差异不显著(P>0.05)(图4: A)；CiTreM2表达量在3个阶段均显著提高(P<0.05)(图4: B)；CiTreS1表达量在早期阶段极显著下降(P<0.01)，在滞育解除阶段极显著提高(P<0.01)，在滞育阶段无显著差异(P>0.05)(图4: C)；CiTreS2表达量在早期阶段显著下降(P<0.05)，在滞育和滞育解除阶段显著提高(P<0.05)(图4: D)。

低温(0℃)驯化15 d后4个基因在同一发育阶段的变化也不同，在早期阶段表达量高低顺序为CiTreM2>CiTreM1>CiTreS2>CiTreS1，在滞育阶段为CiTreM2>CiTreS2>CiTreM1>CiTreS1，在滞育解除阶段为CiTreS1>CiTreS2>CiTreM2>CiTreM1(图4)。

图4 低温(0℃)驯化15 d后意大利蝗卵不同发育阶段海藻糖酶基因的相对表达量Fig. 4 Relative expression levels of CiTre genes in Calliptamus italicus eggs at different developmental stagesafter acclimation to low temperature (0℃) for 15 dA: CiTreM1; B: CiTreM2; C: CiTreS1; D: CiTreS2. 对照组(CK)： 以27℃下的表达量为基准1。图中数值为平均值±标准差，柱上星号和双星号分别代表与对照组差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)(T检验)。The control group (CK): the expression level at 27℃ was taken as the benchmark 1. Data in the figure are means±SD. Asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, from the control group by T-test.

3 讨论

本研究发现，意大利蝗卵海藻糖酶基因有4个拷贝，从其结构和功能分析推测是由两种基因复制而得，4个拷贝具有完整的编码序列和仅存在于海藻糖酶蛋白中的特异性标签及一个保守的海藻糖酶超家族结构域，表明复制基因仍具有海藻糖酶功能，共同参与调控了蝗卵越冬过程中的海藻糖代谢。CiTreS1和CiTreS2蛋白结构不含跨膜结构域，与飞蝗TreS同源性最高，置信度可达100%，说明海藻糖酶基因具有高度保守的进化特征；CiTreM1和CiTreM2在C端含有跨膜结构域，表明其可以跨越细胞质膜进入到细胞周质和细胞内质中发挥作用。CiTre蛋白相似性较高，功能相似，具有类似比例的α-螺旋、β-折叠和无规卷曲，4个基因中仅CiTreM2的编码蛋白在N端含有信号肽，推测该蛋白可能为分泌型蛋白，可进行跨膜转运到其他组织或细胞中去发挥作用(应喜娟等, 2007)。

昆虫体内海藻糖酶基因表达在不同发育阶段差异较大(Guoetal., 2015)。BtTre2在烟粉虱Bemisiatabaci卵和成虫阶段表达水平高于在若虫中的(Wangetal., 2014)；LdTre基因在马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata1-3龄幼虫蜕皮期间表达量较低，蜕皮前后表达量较高，以满足几丁质合成的需求(Shietal., 2017)。本研究表明，对照组(27℃)海藻糖酶基因在意大利蝗卵各发育阶段中均有表达(图3)，这与大多数研究结果(刘晓健等, 2012; 田宇等, 2016; 陈龙等, 2018)一致，但4个海藻糖酶基因在意大利蝗卵不同发育阶段的表达各有特点，CiTreM1表达量先下降后上升，在滞育解除阶段达到最高(图3)，推测其参与分解海藻糖、为蝗卵孵化及几丁质合成提供能量有关。4个海藻糖酶基因中，CiTreM2在滞育阶段的表达量最高(图3)，这与滞育激素可增强家蚕卵海藻糖酶活性的研究结果(Kameietal., 2011)相似。滞育阶段虫体内的滞育激素水平较高(Fukuda and Takeuchi, 1967)，滞育激素可提高海藻糖酶活性(王洪亮等, 2008)，致使蝗卵滞育阶段CiTreM2表达量增加，为维持蝗卵滞育阶段的基础代谢提供能量。4个海藻糖酶基因中，CiTreS1和CiTreM1分别在意大利蝗卵早期和滞育解除阶段的表达量最高(图3)，分析这是由于在早期阶段胚胎需要消耗大量能量快速发育进入滞育状态以顺利越冬，滞育解除后胚胎发育恢复到滞育前的活跃状态(闫蒙云等, 2018)，蝗卵孵化和1龄若虫几丁质外骨骼合成(刘晓健等, 2012)均需能量，它们的高表达可产生更多海藻糖酶诱导海藻糖水解为葡萄糖以补给所需能量。

已有研究报道，越冬期间意大利蝗卵通过积累与抗寒相关的多种游离氨基酸(葛婧等, 2014)，降低过冷却点和呼吸代谢水平(闫蒙云等, 2018; 任金龙等, 2021)及高表达与氧气运载有关的血蓝蛋白基因(王香香等, 2019)等方式应对冬季低温。本研究发现，第一，低温驯化后蝗卵不同发育阶段膜结合型海藻糖酶基因表达量增加，与低温下血蓝蛋白基因Hc2的变化趋势(王香香等, 2019)相同，而可溶型海藻糖酶基因变化与其不一致，研究结果部分验证了提出的假设，分析原因与两类不同的海藻糖酶基因的功能不同有关。可溶型海藻糖酶基因对于昆虫表皮中几丁质合成、碳水化合物摄取以及体内营养动态平衡具有重要意义，膜结合型海藻糖酶基因则主要影响中肠几丁质合成和生长发育过程(张文庆等, 2011)。Chen等(2010)的研究也证实了用Treh-1和Treh-2的dsRNA干扰甜菜夜蛾Spodopteraexigua的幼虫和蛹，结果产生了不同的异常表型。其二，与对照组(27℃)相比，低温驯化后CiTreM基因表达量在3个阶段均增加，CiTreS基因仅在早期阶段表达量下降，其他阶段表达量增加(图4)，说明海藻糖酶基因参与了蝗卵对低温胁迫的应答，这与其他昆虫的研究结果(Shietal., 2016; 汪晓茜, 2018; Lüetal., 2020)相似。其三，低温对海藻糖酶基因的影响与蝗卵发育阶段有关，CiTreM1在蝗卵发育早期阶段存在明显的低温驯化现象，表明蝗卵通过提高CiTreM1表达量分解海藻糖，提高蝗卵对低温胁迫的适应力。CiTreM2在3个发育阶段的表达量均显著高于对照组，并在早期阶段的增幅最大，说明不同发育阶段CiTre基因对温度的敏感性存在差异，此现象在其他昆虫中也有类似发现，如Lü等(2020)发现松毛虫赤眼蜂Trichogrammadendrolimi在低温胁迫后成虫阶段TdTre基因的表达较幼虫更敏感。Kamei等(2011)研究发现家蚕膜结合型海藻糖酶活性的增强能够有效促进滞育激素诱导滞育卵进入深度滞育，利于提高抗寒能力，因此，推测CiTreM2在蝗卵应对低温胁迫时发挥着重要作用。0℃低温驯化15 d后，CiTreS1表达量在意大利蝗卵滞育解除阶段增幅最大(图4)，基于低温驯化前后CiTreS1表达水平和变化幅度最大的事实判断，其在蝗卵滞育解除后快速发育的能量供给和应对低温胁迫如倒春寒天气中发挥着关键作用。

蝗卵发育阶段因产卵时间不同，甚至同一个卵囊内不同卵粒都会不同(任金龙等, 2015a)，为避免因蝗卵不同发育阶段对实验结果产生影响，本研究按照意大利蝗卵发育阶段划分依据，随机选取一定量的蝗卵解剖，当超过90%的卵发育至某一阶段时方进行取样，以确保实验所用蝗卵发育阶段的一致性。不同类型的海藻糖酶基因在应对昆虫所受胁迫中具有一定的协同作用(Shietal., 2019)，同理，蝗卵应对低温胁迫亦并非某一海藻糖酶基因起作用，但不同海藻糖酶基因之间的协作还需进一步探讨，另一方面，本研究仅对海藻糖酶基因进行克隆及低温驯化后基因的表达变化分析，后续还需对基因进行RNA干扰，对其功能进行验证，以进一步揭示海藻糖酶基因在意大利蝗卵越冬中的作用机制。