组织中miR-25-3p水平联合能谱CT定量参数预测非小细胞肺癌患者肺叶切除术治疗预后的研究

杜亮，金澄宇

(新疆维吾尔自治区人民医院 胸外科，新疆 乌鲁木齐 830001)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在肺癌中占比高达85%以上，以腺癌为主要组织学类型[1]。目前肺叶切除术在NSCLC早中期治疗中被广泛应用，疗效确切。而相关研究报道，早中期NSCLC患者仍有一定预后不良风险，可能与肿瘤异质性、肿瘤大小等多方面因素有关[2]。而目前临床尚无有效预测手段，不利于术后治疗方案的制定。研究[3]指出，能谱CT作为一种新技术可有效评估癌组织特征，被作为术前诊断鉴别手段，可反映患者病情及预测预后不良风险。微小RNA(microRNA，miR)参与肿瘤基因表达调控，其中miR-25-3p被证实在肺癌组织中呈异常高表达，可能与患者生存情况有关[4]。推测组织中miR-25-3p水平、能谱CT定量参数可作为NSCLC患者预后预测的辅助手段，但目前相关研究报道较少。基于此，本研究进一步观察组织中miR-25-3p水平联合能谱CT定量参数预测NSCLC患者肺叶切除术治疗预后的效能，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取我院2017年1月至2019年1月收治的116例NSCLC患者作为研究对象，年龄50～68岁，平均(58.12±6.30)岁；男67例，女49例；组织学分型：腺癌79例，鳞癌25例，腺鳞癌12例；分化程度：低分化5例，中分化32例，高分化79例；TNM分期[5]：Ⅰ期98例，Ⅱ期18例。我院医学伦理委员会批准本研究，患者及家属签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

(1)纳入标准：①符合NSCLC诊断标准[6]，经术前穿刺活检确诊；②均为初次发病；③符合肺叶切除术治疗的适应证：周围性肺癌或局限于肺叶内的不可逆病变；④可耐受能谱CT检查，且患者病灶实性部分足够测量。(2)排除标准：①入组前接受过化疗或免疫治疗的患者；②患有感染性疾病的患者；③一侧肺部病变，对侧肺功能也不全的患者；④凝血功能异常的患者；⑤麻醉耐受性差者。

1.3 方法

1.3.1 收集资料 记录患者年龄、性别、组织学分型、分化程度、饮酒史、吸烟史、高脂血症史、糖尿病史、高血压史、淋巴结转移情况、TNM分期、病灶最大直径，其中组织学分型、分化程度、淋巴结转移情况、TNM分期、病灶最大直径以手术病理学检查结果进行评估。

1.3.2 组织中miR-25-3p水平 检测试剂盒及试剂均由南京凯基生物技术发展有限公司提供。于治疗前检测组织中miR-25-3p水平，行穿刺活检，取肿瘤中外1/3交接处癌组织标本，避免钙化或坏死部分，存储于-80 ℃冰箱中。用裂解液将冻存标本研磨成匀浆状，使用RNA提取试剂盒提取组织RNA，采用美国Thermo公司紫外分光光度计评估RNA纯度和浓度。应用逆转录试剂盒行逆转录反应，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反应体系总体积20 μl，引物序列为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAA-3′，获得cDNA。采用ABI 7500 Fast Star定量PCR仪检测miR-25-3p表达水平，反应条件为:95 ℃ 90 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s,共40个循环。上游引物(5′-3′)为GGAATGTTGCTCGGTGA，下游引物(5′-3′)为CAGTGCGTGTCGTGGA。以U6为内参：上游引物(5′-3′)为CGCTTCGGCAGCACATA，下游引物(5′-3′)为TTCACGAATTTGCGTGTCAT。采用2-ΔΔCt计算miR-25-3p相对表达量。

1.3.3 能谱CT定量参数 应用美国GE公司宝石能谱CT(Discovery CT750 HD)行胸部平扫及双期增强扫描，患者取仰卧位，扫描参数：管电压为高、低能量(80 kVp 与140 kVp)瞬时(0.5 ms)切换，自动毫安，螺距1.375∶1，层间距5.0，层厚5.0 mm，矩阵512×512，准直64×0.625 mm，机架旋转时间0.6 s，扫描范围包括肺尖至肋膈角水平。行平扫后经肘正中静脉输注非离子型对比剂碘海醇1.6 ml·kg-1，时间≤30 s，监测胸主动脉CT值，到达150 HU阈值后延迟5.7 s开始扫描，获得动脉期图像后延迟30 s获得静脉期图像。将所得图像上传至GE AW4.6工作站，由2名主治医师完成阅片。选取病灶实性成分作为感兴趣区(region of interest，ROI)，各期ROI在相邻3个层面上各测量1次，大小、形态及位置保持一致，取平均值。记录平扫有效原子序数(effective atomic number，Eff-Z)，计算病灶处动、静脉期标准化碘浓度(normalized iodine concentrations，NIC)，NIC=病灶ROI内碘含量/主动脉碘含量。

1.3.4 预后评估 患者均行肺叶切除术治疗，对术前穿刺活检显示有淋巴结转移的患者行术中淋巴结清扫术治疗，手术均顺利实施，术后复查CT证实病灶切除干净。随访并指导患者到院复查，采用CT检查评估患者复发情况，以复发为终点事件，根据复发情况将患者分为预后不良组与预后良好组，比较两组基线资料、组织中miR-25-3p水平及能谱CT定量参数，分析组织中miR-25-3p水平联合能谱CT定量参数对NSCLC患者肺叶切除术治疗预后的预测效能。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 NSCLC患者复发情况

随访19～24个月，平均随访时间(20.68±3.59)个月。116例NSCLC患者中有20例复发，复发率为17.24%；经KM法绘制复发曲线显示，20例复发NSCLC患者中位复发时间为18个月(95%置信区间：15.809～20.191个月)。见图1。

图1 NSCLC患者复发Kaplan-Meier曲线Fig 1 Kaplan-Meier curve of recurrence in patients with NSCLC

2.2 预后不良组与预后良好组基线资料、miR- 25- 3p及能谱CT定量参数比较

两组淋巴结转移、TNM分期占比比较，差异有统计学意义(P<0.05)；预后不良组miR-25-3p相对表达量高于预后良好组，平扫Eff-Z、静脉期及动脉期NIC低于预后良好组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组年龄、性别、组织学分型、分化程度、饮酒史、吸烟史、高血脂史、糖尿病史、高血压史、病灶最大直径比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 预后不良组与预后良好组基线资料、miR-25-3p及能谱CT定量参数比较Tab 1 Comparison of baseline data,miR-25-3p and energy spectrum CT quantitative parameters between poor prognosis group and good prognosis group

2.3 NSCLC患者肺叶切除术治疗预后影响因素的Cox回归分析

将患者预后作为因变量(1=预后不良，0=预后良好)，将淋巴结转移、TNM分期、miR-25-3p相对表达量、平扫Eff-Z、静脉期及动脉期NIC作为自变量，对自变量进行赋值(表2)。经Cox回归分析结果显示，淋巴结转移、TNM分期、miR-25-3p相对表达量、平扫Eff-Z、静脉期及动脉期NIC是NSCLC患者肺叶切除术治疗预后的影响因素(P<0.05)，见表3。

表2 自变量说明与赋值情况Tab 2 Description and assignment of independent variables

表3 NSCLC患者肺叶切除术治疗预后影响因素的Cox回归分析结果Tab 3 Cox regression analysis results of influencing factors of prognosis of patients with NSCLC treated by pulmonary lobectomy

2.4 组织中miR- 25- 3p水平联合能谱CT定量参数预测预后的价值

将患者预后作为状态变量(1=预后不良，0=预后良好)，将miR-25-3p相对表达量、平扫Eff-Z、动脉期NIC、静脉期NIC作为检验变量，绘制ROC(图2)，结果显示，组织中miR-25-3p水平联合能谱CT定量参数用于预测患者预后的AUC为0.880，有一定预测价值。ROC相关参数详见表4。

表4 组织中miR-25-3p水平联合能谱CT定量参数预测预后的ROC参数Tab 4 ROC parameters of miR-25-3p level in tissues combined with quantitative parameters of energy spectrum CT in predicting prognosis

图2 组织中miR-25-3p水平联合能谱CT定量参数预测预后的ROC曲线图Fig 2 ROC curve of miR-25-3p level in tissues combined with quantitative parameters of energy spectrum CT in predicting prognosis

3 讨 论

因影像学诊断技术的进步，NSCLC早中期诊断率提高，利于患者及早实施治疗。但NSCLC发病机制复杂，涉及到遗传、环境多种因素的相互作用，患者术后复发转移机制复杂，预后尚难以有效预测[7]。

大量研究[8-9]指出，早期NSCLC患者仍有一定预后不良风险，患者多项病理特征与患者预后不良密切相关。本研究结果显示，116例NSCLC患者复发率为17.24%，中位复发时间为18个月，说明NSCLC患者术后短期预后不良风险高，与上述研究结论一致。初步比较预后不良组与预后良好组基线资料、miR-25-3p及能谱CT定量参数后，经Cox回归分析结果显示，淋巴结转移、TNM分期、miR-25-3p相对表达量、平扫Eff-Z、静脉期及动脉期NIC是NSCLC患者肺叶切除术治疗预后的影响因素，其中淋巴结转移、TNM分期是既往临床用于预测肿瘤预后的常用手段。赵裕欢等[10]研究证实，NSCLC患者淋巴结转移可增加预后不良风险，尽管部分患者为淋巴结微转移，也可增加术后复发转移风险，影响患者生存率。TNM分期可综合反映肿瘤原发病灶、侵袭及转移情况，进而反映肿瘤异质性，与患者病情进展及预后均有关[11]。因此，淋巴结转移、TNM分期对预测NSCLC患者预后有一定价值。而仅通过淋巴结转移、TNM分期评估NSCLC患者预后尚有局限，特异度和灵敏度尚不理想。

miR作为调节基因表达与细胞信号通路的非编码小分子RNA，可通过促进肿瘤血管生成、调控抑癌基因表达等多种机制参与肿瘤进展，已被作为肿瘤预后的有效预测手段[12]。miR-25-3p是其中一种，可靶向调节神经源性基因Notch同源蛋白1，而神经源性基因Notch同源蛋白1可调节细胞发育、增殖、分化及凋亡[13]。miR-25-3p在NSCLC中作为致癌因子，在miR-25-3p表达上调时Notch信号紊乱，Notch同源蛋白1表达上调，癌细胞易发生生长、侵袭和转移，患者预后不良风险高[14]。miR-25-3p还可靶向调控B细胞易位基因2，促使肿瘤进展，进一步增强肿瘤恶性生物学行为[15]。此外，相关研究[16]还指出，miR-25-3p表达上调可反馈为NSCLC患者肿瘤分化程度低、恶性程度高、转移风险高，因此与NSCLC患者预后不良密切相关。但本研究未能对miR-25-3p与肿瘤分化程度及转移情况的相关性进行分析，未来还应进行进一步探讨。能谱CT以单源瞬时kVp切换技术为基础，可得到连续单能量图像，并行能谱重建，可进一步获取多种定量参数[17]。平扫Eff-Z、静脉期及动脉期NIC可用于鉴别病灶性质，三者低可反映肿瘤生长、侵袭能力强，新生血管无法满足肿瘤供血需求，且肿瘤内部有较多的黏液、坏死成分，并有微出血发生，病灶表现为血供不足，进一步反映了肿瘤恶性程度高，患者预后不良风险高[18-19]。

进一步绘制ROC，结果显示，组织中miR-25-3p水平联合能谱CT定量参数用于预测患者预后的AUC>0.85，有一定预测价值。说明组织中miR-25-3p水平联合能谱CT定量参数对NSCLC患者肺叶切除术治疗预后有一定预测效能。联合预测可弥补单项预测的不足之处，从不同方面反映患者不良预后风险，获得理想的特异度和灵敏度。临床可将miR-25-3p作为NSCLC患者的新治疗靶点，并可对术前预测为高预后不良风险的患者实施辅助放化疗治疗。而因本研究未能观察NSCLC患者细胞免疫、体液免疫功能及血清肿瘤标志物水平，结论尚有局限，未来还应纳入NSCLC患者的多项资料，进一步分析NSCLC患者肺叶切除术治疗预后的有效预测指标，为临床治疗提供参考意见。

综上所述，组织中miR-25-3p水平联合能谱CT定量参数对NSCLC患者肺叶切除术治疗预后有一定预测效能，可根据术前检测结果对患者实施针对性治疗。