凤仙花近缘种间核型分析与叶表皮微形态研究

梁晓丽 舒慧娟 王婷 蔡秀珍 丛义艳 旷仁平

摘 要：  為探究凤仙花近缘种植物的细胞学和微形态学方面的亲缘关系，该文选取荔波凤仙花（Impatiens liboensis）及近缘种赤水凤仙花（I. chishuiensis）和管茎凤仙花（I. tubulosa）的根尖和叶表皮为实验材料，采用体细胞染色体常规压片法和叶表皮光学显微镜观察法对凤仙花近缘种植物进行染色体及叶表皮特征研究。结果表明：（1） 3种近缘种凤仙花核型均为2B。荔波凤仙花染色体数目为2n=16，核型公式为2n=2x=16=6m+4sm+2st+4T;赤水凤仙花染色体数目为2n=14，核型公式为2n=2x=14=12m+2sm;管茎凤仙花染色体数目为2n=14和2n=18，核型公式为2n=2x=14=4m+4sm+6T和2n=2x=18=4m+2sm+12T。（2） 3种近缘种凤仙花叶表皮细胞均为不规则形，垂周壁式样有浅波状、波状两种;上表皮不具气孔器，下表皮均具气孔器;气孔指数和气孔密度差异大，可作为种间的分类依据。该文首次报道荔波凤仙花和赤水凤仙花的染色体数目、核型情况和叶表皮微形态特征。综上结果认为，凤仙花属植物的物种多样性可反映在高度可变的染色体数目和叶表皮形态上，染色体核型特征和叶表皮微形态特征对探讨凤仙花属种间亲缘关系、地理分布格局具有一定的科学意义，也可作为其分类的参考依据。

关键词： 荔波凤仙花， 赤水凤仙花， 管茎凤仙花， 细胞学， 微形态学， 亲缘关系， 分类学

中图分类号：  Q949.755.7

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2022）01-0152-09

收稿日期：  2021-04-26

基金项目：  科技部“国家科技基础条件平台”项目 （Y5217G1006）; 国家科技基础资源调查专项（2019FY101800）[Supported by the National Platform for Basic Conditions of Science and Technology （Y5217G1006）; the National Science and Technology Basic Resources Survey Project （2019FY101800）]。

第一作者： 梁晓丽（1996-），硕士研究生， 主要从事植物分类学研究， （E-mail）1215426476@qq.com。

*通信作者：  旷仁平， 博士， 讲师， 硕士生导师， 主要从事植物系统分类学、植物学教学和科研等工作， （E-mail）715678818@qq.com。

Research on karyotype analysis and leaf epidermal

micromorphology of related species of Impatiens

LIANG Xiaoli1，2， SHU Huijuan1，2， WANG Ting1，2， CAI Xiuzhen1，2，

CONG Yiyan1，2， KUANG Renping1，2*

（ 1. College of Life Sciences， Hunan Normal University， Changsha 410081， China; 2.  Hunan Province Key Laboratory

of Crop Sterile Germplasm Resource Innovation and Application， Changsha 410081，  China ）

Abstract：  Impatiens L. （Balsaminaceae） is a genus that contains ca. 1 000 species mainly distributed in tropical and subtropical regions of Asia and Africa. Several studies have been carried out within this genus， however， there is still paucity in the karyotype research. In order to explore the genetic relationship of cytological and micromorphological characters among related species of Impatiens， the chromosome and leaf epidermal characteristics of the genus were studied. Here， we report the chromosome analysis and leaf epidermal characteristics of three related Imaptiens species， I. liboensis， I. chishuiensis and I. tubulosa， using conventional squash method together with light microscopy observations. The results were as follows： （1） The karyotypes of all these three species were 2B. I. liboensis， the chromosome number was 2n=16， and the karyotype formula was 2n=2x=16=6m+4sm+2st+4T， whereas， for I. chishuiensis， the chromosome number was 2n=14， and the karyotype formula was 2n=2x=14=12m+2sm. Additionally， in I. tubulosa， the chromosome number was 2n=14 or 2n=18， and the karyotype formula was 2n=2x=14=4m+4sm+6T or 2n=2x=18=4m+2sm+12T. （2） In terms of leaf epidermal characteristics， the shape of epidermal cells for these species was irregular， with anticlinal walls sinuolate or sinuous; Stomata were only observed from the abaxial side; The stomatal index and stomatal density of the three species of Impatiens were quite different， and can be used for the taxonomy of these three Imaptiens species. The chromosome number， karyotype and leaf epidermal characteristics of I. liboensis and I. chishuiensis were reported for the first time. Therefore， the high species diversity in Impatiens is reflected in the hypervariable chromosome number and leaf epidermis， chromosome karyotype and leaf epidermal characteristics hence could be used to study the relationship and geographical distribution of the genus Impatiens and as important features for its taxonomy.

Key words： Impatiens liboensis， Impatiens chishuiensis， Impatiens tubulosa， cytotaxonomic， micromorphology， genetic relationship， taxonomy

凤仙花科（Balsaminaceae）包括水角属（Hydrocera Bl.）和凤仙花属（Impatiens L.），其中凤仙花属植物全世界有1 000余种，主要分布于亚洲和非洲的热带和亚热带地区（Grey-wilson et al.， 1980;Yu et al.， 2016）。我国已知270余种，其中240余种为中国特有种，主要分布于我国西南地区，该地区和东喜马拉雅山地是世界凤仙花物种五大多样性中心之一（陈艺林，2001;于胜祥，2012）。近年来，随着植物学者们的逐步深入调查，这些地区陆续有新种发现（Kuang et al.， 2014;Ding et al.， 2017;Peng et al.， 2020;Zou et al.， 2020;Peng et al.， 2021;Liao et al.， 2021）。

目前，国内外专家对凤仙花属区系研究越来越深入，但该属的核型研究工作相对滞后。现有报道凤仙花属植物的核型研究主要集中在非洲、亚洲部分地区（印度、中国-喜马拉雅地区）等（Smith， 1934;Khoshoo， 1955， 1957， 1966;Jones & Smith， 1966;Rao， 1975;Gill & Chinnapps， 1977;Zinov′eva-Stahevitch & Grant， 1984;Takashi et al.， 1994， 1997;Song et al.， 2003;Tatyana et al.， 2017; Chandan et al.， 2019），研究发现该属单倍体染色体数目在n=3至n=33之间，表明了该属植物的染色体数目具有很大的可变性，这一系列染色体数目之间存在典型的非整倍体进化关系，主要集中在印度-喜马拉雅山一带。学者Jones & Smith（1966）认为喜马拉雅山脉代表凤仙花属的起源中心;Takashi等（1994）报道了采自云南西南部的10种凤仙花的染色体数目和核型，并认为这些种与喜马拉雅的凤仙花有较近的亲缘关系。总体而言，我国凤仙花种质资源丰富，但该属的染色体资料还相对较为匮乏，这些种类是否起源于喜马拉雅地区或者与喜马拉雅地区的凤仙花有较近的亲缘关系尚未有定论。

随着对凤仙花属植物的调查和研究，研究者为弄清本属植物不同类群之间的关系，在形态解剖学、孢粉学、分子系统学上做了大量的研究，而关于凤仙花属叶表皮微形态特征的研究报道较少。丛义艳等（2007）报道了6种国产凤仙花属植物的叶表皮微形态特征;高萌等（2011）报道了6种中国石灰岩地区凤仙花叶表皮微形态特征;李景照等（2020）研究了奇异凤仙花的微形态特征，发现该种表皮结构具有典型的梭形结构，反映了该种的高度特化。这些研究表明凤仙花属植物叶表皮的某些形态特征在种内较稳定，在不同类群间存在差异，可为属内分类提供一定依据，有利于厘清该属的系统演化地位和意义。

本研究的荔波凤仙花（Impatiens liboensis）、赤水凤仙花（I. chishuiensis）和管茎凤仙花（I. tubulosa） 3种凤仙花属植物在形态学上为近缘种，且均为中国特有种。结合前人的研究，本文对3种近缘种凤仙花属植物的细胞分类学和叶表皮微形态学特征进行研究，探讨3种近缘种间亲缘关系、种内核型特征以及细胞地理学，增补了凤仙花属细胞学和细胞地理学空白资料，以期为凤仙花属植物的分类、种质资源鉴定提供细胞学和微形态学的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为荔波凤仙花7份，赤水凤仙花7份，管茎凤仙花10份，共24份样品。材料采自贵州赤水、荔波以及湖南衡阳等地，凭证标本存于湖南师范大学植物标本馆（HNNU），材料名称及来源详见表1。叶片实验材料均用FAA固定液处理，备用;待返校后进行微形态研究。活体材料移栽种植于湖南师范大学植物园，以备后续的染色体实验和分子生物学研究。

1.2 方法

1.2.1 染色体材料制备及核型参数获取 凤仙花属植物根尖染色体的制备参照刘永安等（2006）的方法，采用常规压片法。（1）取材与预处理：取材时间为9：00—11：00，每植株取约10个根尖，长0.5～1 cm，用蒸馏水洗净，用0.1%秋水仙素浸泡置于4 ℃条件下暗处理4 h，破坏细胞纺锤体的形成，使其停留在有丝分裂中期。（2）固定及保存：上述预处理材料，用蒸馏水洗净（3次以上），卡诺氏固定液中固定24 h，使染色体保持原有形態，获得形态完整的染色体。（3）解离：吸掉卡诺固定液，充分洗净，加入1 mol·L-1盐酸于60 ℃水浴锅解离10～12 min，期间摇晃数次，充分解离。（4）染色：解离后清洗数次，加入改良苯酚品红染色液，放入4 ℃冰箱中进行染色4 h以上。（5）制片与镜检：切取根尖，长约1 mm，用45%～50% 的冰醋酸溶液对根尖进行分色，常规压片，并进行镜检、拍照。（6）核型观察：每种材料选自处于有丝分裂中期的细胞进行观察，选取30个染色体分散较好、清晰度高的细胞进行染色体统计计数，实验重复2次。核型分析采用李懋学和陈瑞阳（1985）、Levan（1964）的方法;核型分类参照Stebbins（1971）的标准，按核型中最长染色体长度与最短染色体长度的比值及臂比大于2的染色体所占比例划分决定核型分类;判断核型对称性采用Arano（1963）的方法，核型不对称系数（As·k%）=长臂总长/全组染色体总长，核型不对称系数越接近50%，核型的对称程度越高，进化程度越原始。测量染色体长度的软件为Image Tool图像处理软件V2.0.1。荔波凤仙花及其近缘种植物染色体的测量参数详见表2。

1.2.2 叶表皮微形态观察 实验材料均为野外采集时用FAA固定的新鲜叶片，每个种选取10份中部健康完整无虫害的叶片，将叶片从FAA固定液中取出，用清水漂洗3次，再放入35%的NaClO溶液漂白3～6 h。用镊子撕取叶片上、下表皮，制成临时装片，光学显微镜下进行观察、拍照。每个物种随机取30个视野，于40倍物镜下观察并记录每个视野内的气孔数目、测量长轴与短轴。对于叶表皮气孔器长宽比、气孔指数（SI）、气孔密度（SD）、气孔器类型的划分及相关术语均参照Dilcher（1974）的相关研究。（1）气孔器长宽比=气孔器均长/气孔器均宽;（2）气孔指数（SI）=气孔数目/（气孔数目+表皮细胞数目）×100%（1 mm2内）;（3）气孔密度（SD）=观察面积内气孔器个数/观察面积（1 mm2内）。

2 结果与分析

2.1 荔波凤仙花与近缘种间染色体核型分析

2.1.1 荔波凤仙花的核型分析 本研究中荔波凤仙花的染色体数目和核型特征为首次报道。荔波凤仙花的染色体数目为2n=16，核型公式为2n=2x=16=6m+4sm+2st+4T，其中：有3对中部着丝粒染色体;2对近中部着丝粒染色体;1对近端部着丝粒染色体;2对端部着丝粒染色体。染色体相对长度变化范围为3.98%～9.45%，染色体长度比3.01>2∶1且臂比>2的染色体数目为4，故其核型为2B （图1：A-C）。荔波凤仙花的核型不对称系数为69.90%，显示了一定的不对称性，说明荔波凤仙花在进化过程中不处于比较原始的地位。

2.1.2 近缘种赤水凤仙花的核型分析 本研究中赤水凤仙花的染色体数目和核型特征为首次报道。赤水凤仙花的染色体数目为2n=14，核型公式为2n=2x=14=12m+2sm，其中：有6对中部着丝粒染色体;1对近中部着丝粒染色体。染色体相对长度变化范围为3.27%～10.50%，染色体长度比2.97>2∶1且臂比>2的染色体数目为2，故其核型为2B （图1：D-F）。赤水凤仙花的核型不对称系数为57.51%，显示了较高的对称性，说明赤水凤仙花在进化过程中处于比较原始的地位。

2.1.3 近缘种管茎凤仙花的核型分析 管茎凤仙花的染色体数目为2n=14和2n=18，核型公式为2n=2x=14=4m+4sm+6T和2n=2x=18=4m+2sm+12T。染色体相对长度变化范围为3.37%～10.84%，染色体长度比分别为3.19和3.17>2∶1且臂比>2的染色体数目为2，所以其核型均为2B （图1：G-L）。管茎凤仙花的核型不对称系数分别为75.21%和83.12%，显示了较高的不对称性，说明管茎凤仙花在进化过程中处于比较进化的地位。

2.2 荔波凤仙花与近缘种之间核型对称性比较分析

植物的核型进化趋势是由对称向不对称发展，系统演化上处于较古老或原始的类群具有对称的核型，处于较进化或特化的类群具有不对称的核型（Stebbins， 1971;李娅琼和崔茂应，2014;郭玉洁等，2018;李永平等，2020;陈永毕等，2021）。因此，以凤仙花属植物的平均臂比为横坐标，染色体长度比为纵坐标作图（图2）可知，3种凤仙花属植物的坐标点反映了它们的不对称性、亲缘关系以及进化程度，坐标点越靠近坐标轴左下方，该植物的核型不对称性越低，在进化过程中越原始;相反，越靠近右上方，核型不对称性越高，进化程度越高，该物种越进化。这3种凤仙花属植物的核型均为2B，证实了赤水凤仙花、管茎凤仙花与荔波凤仙花的亲缘关系较近（图2）。赤水凤仙花和荔波凤仙花到达原点的距离相似，两者亲缘关系较近;管茎凤仙花比荔波凤仙花到达原点的距离较远，两者亲缘关系稍远。荔波凤仙花的核型不对称系数为69.90%，赤水凤仙花的核型不对称系数为57.51%，管茎凤仙花的核型不对称系数为75.21%和83.12%。据此表明，三种凤仙花植物在进化趋势中，赤水凤仙花较为原始，荔波凤仙花次之，管茎凤仙花则比较进化。

2.3 荔波凤仙花与近缘种间叶表皮微形态特征分析

3种凤仙花属植物叶表皮微形态特征的光学显微镜结果见图3，其叶表皮微形态特征见表3。

2.3.1 表皮细胞形态及垂周壁式样 3种凤仙花属植物的叶表皮细胞形状均为不规则形，垂周壁式样有浅波状、波状两种，不同种类之间叶表皮细胞垂周壁的弯曲程度不同，如管茎凤仙花的上表皮垂周壁式样为浅波状或波状，而荔波凤仙花和赤水凤仙花的上表皮垂周壁式样均为波状。3种凤仙花属植物上表皮均不具气孔器，下表皮均具有气孔器，但不同种类之间的气孔密度和气孔指数差别明显（图3）。

2.3.2 气孔器特征 3种凤仙花属植物气孔器均分布在下表皮，气孔器类型均为无规则型，形状为椭圆形或长椭圆形两种，如管茎凤仙花的气孔器形状为椭圆形或近圆形，荔波凤仙花和赤水凤仙花的气孔器形状为长椭圆形。气孔器在下表皮上的数目、大小在不同的种间存在明显差异。荔波凤仙花气孔器大小范围是11.71 μm×8.65 μm～15.49 μm×12.05 μm，赤水凤仙花气孔器大小范围是11.92 μm×8.57 μm～18.34 μm×14.50 μm，管茎凤仙花气孔器大小范围是9.80 μm×8.69 μm～14.21 μm×12.61 μm。叶片下表皮气孔指数最高的是管茎凤仙花，赤水凤仙花次之，最低的为荔波凤仙花，气孔指数分别为21.62%、21.35%、18.18% （表3）。

3 討论与结论

3.1 荔波凤仙花近缘种间核型研究及亲缘关系探讨

Khoshoo（1957）在1957年提出x=7，10是原始的染色体基数类型;Rao（1975）认为x=8可能是原始的染色体基数，基数x=7，9，10是从基数x=8进化到下降和上升的异倍体。其他染色体基数以非整倍性变异和上升或下降变异为主，使染色体的数目增加或减少。Song等（2003）对亚洲西南地区的45种凤仙花属植物进行了相关研究，认为最常见的染色体基本数目与凤仙花属植物的地理分布具有一定相关性，染色体基数x=7，8，9，10分布于喜马拉雅地，也很可能是凤仙花属原始的染色体基数候选类型。Yu等（2016）基于ITS、atpB-rbcL和trnL-F序列构建的系统发育树，提出Clade Ⅰ类群是一个相对自然的类群，处于系统发育树的基部，赤水凤仙花和管茎凤仙花位于Clade Ⅰ类群，该分支均为侧生萼片，为4枚，四心皮，花粉粒具3萌发孔的类群。从现有的观测数据和实验结果可以看出，3种近缘种凤仙花的核型特征和进化趋势与前人研究结果相吻合。由此推测，荔波凤仙花、赤水凤仙花和管茎凤仙花3种近缘种属于原始的染色体基数类型，可能起源于喜马拉雅或与喜马拉雅地区的凤仙花有较近的亲缘关系。

3.2 管茎凤仙花染色体数目的变异与进化

凤仙花属植物染色体数目多样，不仅在各种间出现变化，而且在多数种内也有变化。本研究采集于湖南衡阳衡山的管茎凤仙花，染色体数目2n=14和2n=18，核型是2B，核型公式为2n=2x=14=4m+4sm+6T和2n=2x=18=4m+2sm+12T，而方亮（2011） 报道的管茎凤仙花采集于江西九连山，染色体数目为2n=18，核型是1C，核型公式为2n=2x=18=4m+2sm+12T。研究结果的不同可能是管茎凤仙花种内的变异在有丝分裂过程中的配子不平衡分离所致，还可能跟遗传进化与所处的地理环境有一定的相关性。湖南衡阳衡山的管茎凤仙花分布点海拔较高，在气候严酷而不稳定的生态因子下，对染色体数目产生巨大的影响。这为凤仙花属植物细胞分类学研究积累了原始的资料，也为研究中国凤仙花属植物群落分布与地理位置差异的关系提供一定的理论基础。

3.3 叶表皮微形态特征反映的种间亲缘关系及地理分布

许多研究表明，叶表皮的微形态特征的多样性在一定程度上能反映属内类群的分化、类群间的亲缘关系，并可用于植物种间或属间分类、植物系统演化关系的探讨。张晓霞等（2013）对36种凤仙花属植物的叶表皮微形态特征进行研究发现叶表皮微形态特征与地理分布具有一定相关性，结果发现管茎凤仙花归在Group Ⅲ类群中，该种的上表皮垂周壁式样为浅波状，下表皮垂周壁式样为波状，主要分布在中国南部和中部地区。从植物地理分布角度看，荔波凤仙花仅分布在贵州荔波县;赤水凤仙花分布在贵州、广西;管茎凤仙花分布较广，我国浙江、江西、湖南、福建、广东、广西等地均有分布，本研究结果和张晓霞等（2013）的结论相一致。因此，凤仙花叶表皮微形态特征可为该科系统发育、属间、种内鉴定提供有价值的分类学佐证。

本研究的3种近缘种凤仙花属植物叶表皮微形态特征表现出较高的一致性，进一步证实了荔波凤仙花、赤水凤仙花和管茎凤仙花之间的亲缘关系较近。但是上下表皮垂周壁式样、气孔器类型、气孔指数、气孔密度等特征存在差异，这些差异可为凤仙花属物种间的鉴定提供一定的科学分类依据。本文仅选择了3种中国特有种进行研究，叶表皮对于凤仙花属的属下分类意义还需要更深入的研究。

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（责任编辑 周翠鸣）

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