鸡传染性喉气管炎实验室诊断与序列分析

王文彬，伏春燕，阎佩佩，石天虹，李霞，魏祥法，刘瑞亭，董以雷，刘雪兰

摘 要：从山东省东营市某养鸡企业采集具有呼吸道症状及产蛋障碍的蛋鸡组织共8份，经病史与免疫程序调查、病鸡的临床症状与组织病理变化，初步怀疑是传染性喉气管炎、传染性支气管炎或低致病性禽流感病毒感染。通过病毒血凝试验排除了低致病性禽流感病毒;通过PCR方法确定为传染性喉气管炎病毒感染;最终对扩增的病毒gD基因与TK基因进行测序并与BLAST比对分析，发现该病毒与疫苗毒株同源性高达99%。以上结果表明，传染性支气管炎疾病的免疫接种仍然重要。

关键词：传染性喉气管炎;实验室诊断;PCR;序列分析

中图分类号：S816.7 文献标识码：B文章编号：1673-1085（2022）01-0006-06

传染性喉气管炎（infectious laryngotracheitis， ILT）是由传染性喉气管炎类病毒（infectious laryngotracheitis virus， ILTV）引起的鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。该病主要侵害鸡喉头和气管的上皮细胞，同时也对鼻窦、气囊和肺等组织产生影响，其特征为呼吸困难、咳嗽，喉和气管黏膜肿胀、出血并形成糜烂[1]。我国于20世纪50年代末期首次发生该病，90年代后该病在我国一些地区呈地方性流行，常引起病鸡死亡和产蛋下降，导致严重经济损失，给我国养鸡业造成巨大危害[2]。2021年5月，山东东营某养鸡场海兰褐蛋鸡在15～20日龄时出现过一过性的呼吸道症状，剖检发现肾脏肿大，但未引起重视;在80日龄开始发现鸡群5%左右出现龙骨弯曲;直至影响鸡群的产蛋率。本研究采集具有典型病理变化的病鸡组织进行ILT、传染性支气管炎（IB）及低致病性禽流感H9N2的PCR鉴别检测、测序分析，最终确定感染病原为ILTV。

1 材料与方法

1.1 病料与试验动物

病料来自于山东东营某养鸡场病鸡的喉头、气管、输卵管和肺组织;9～11日龄SPF鸡胚购自山东昊泰实验动物繁育有限公司。

1.2 主要试剂和引物

Simple P病毒DNA/RNA共提取试剂盒，购自杭州博日科技股份有限公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自OMEGA公司;2×Taq预混 PCR反应体系（含染料）、StarScript II cDNA第一链合成试剂盒-II、Direct-load StarMarker D2000 Plus，购自康润生物;T4 DNA Ligase与19T simple

vector，购自大连宝生物工程有限公司。根据参考文献，由青岛擎科生物有限公司合成扩增ILTV gD[3]、ILTV TK[4]、IBV M[5]、IBV N[5]、H9N2 NP基因的引物，详细引物序列见表1。

1.3 病料处理

在无菌条件下，剖检观察各组织病理变化，采集病鸡的喉头、气管、输卵管和肺组织，共8份，称取适量以上组织与无菌PBS按照M/V=1：1混匀，用组织研磨仪进行匀浆，反复冻融3次，6000 rpm/min离心10 min，取上清，置-80 ℃冰箱备用。

1.4 病毒血凝试验

将1.3处理的病料上清进行10倍稀释，原液与稀释液经鸡胚尿囊膜途径接种9～11日龄SPF鸡胚各5枚，100 μL/胚，设立PBS对照，置于37 ℃孵育5 d，每天观察鸡胚死亡情况，弃去24 h内死亡鸡胚，5 d后在无菌条件下取出尿囊液，按照常规血凝试验（HA）操作方法测定鸡红细胞的凝集价。以新城疫病毒疫苗株La Sota作为阳性对照，PBS为阴性对照。

1.5 病料基因组提取与PCR鉴定

按照试剂盒说明书提取病料上清中的DNA/RNA，并进行反转录。根据表1中引物进行PCR鉴定。PCR反应体系为2×Taq 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板（DNA或cDNA）2 μL，ddH2O至终体积20 μL。PCR扩增条件为94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，30个循环;72 ℃ 5 min。每組引物设ddH2O为阴性对照。1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

1.6 PCR产物回收与序列分析

按照胶回收试剂盒说明书回收阳性PCR产物，然后送往青岛擎科生物有限公司进行测序。利用BLAST软件分析得到序列与已有毒株序列的同源性及突变情况。

2 结果与分析

2.1 发病情况与临床症状

海兰褐蛋鸡在80日龄开始出现龙骨弯曲，占5%左右。165日龄时产蛋率下降，软壳蛋和砂壳蛋多，偶见畸形蛋;粪便不成型，腹泻;吐水，呕吐物没有异味，嗉囊解剖没发现霉菌症状;羽毛尤其是主翼羽有分叉，毛囊没有变化。免疫程序中缺乏ILT的免疫。其他饲养条件均正常。

2.2 剖检观察

濒临死亡的病鸡鼻腔内有大量的黏液（图1A），堵塞呼吸通道。病鸡存在腹泻症状，可观察到肛门处有粪便粘连（图1B）。对病鸡进行剖检，发现龙骨明显弯曲（图1C）;喉头与气管出血明显（图1D），同时伴有大量黏液渗出;输卵管的蛋壳腺部（子宫部）内出现大量白色沉积物（图1E）。其他组织没有明显病理变化。结合临床症状，我们推测病鸡可能感染了ILTV、IBV或低致病性禽流感病毒。

2.3 病毒血凝试验

病料原液及10倍稀释液接种鸡胚后，鸡胚均没有死亡;胚体发育良好，鸡胚尿囊液对鸡红细胞均无血凝性（图2）。此结果表明病鸡可能没有感染新城疫病毒、禽流感病毒。

2.4 分子鉴定

分别扩增疑似病毒ILTV、IBV、H9N2的相关基因，电泳结果显示，只有ILT扩增成功，其中gD基因长度为1 134 bp，TK基因长度为400 bp（图3）。利用NCBI的BLAST软件对测序后的gD、TK的核苷酸与氨基酸序列进行同源性比对，结果显示两个基因核苷酸与氨基酸序列与已有的基因序列同源性高达99%以上（图4）。结合临床症状与病理变化结果，可以确定导致该养殖场鸡死亡的病原为ILTV。

3 討论与结论

在我国，ILT属于二类动物传染性疫病，是对养鸡业危害较大的传染病之一[6]。目前，ILT的发生主要以散发为主，且该病除表现出典型的呼吸道症状外，蛋鸡还伴随有产蛋率迅速下降、蛋品质降低等症状，这给临床鉴别诊断带来难度。临床生产中，该病与IB极其相似。两者均具有传染性，病鸡均表现出咳嗽、鼻腔分泌物增多、呼吸困难，且蛋鸡感染后均会出现产蛋率下降等产蛋障碍。两者的区别在于ILT剖检病变主要集中在喉、气管黏膜充血和出血，而IB除有气管支气管水肿外，肝脏呈土黄色，轻度肿大，肾小管和输尿管沉积大量的尿酸盐，形成“花斑肾”[2]。因ILT与IB的病原不同，因此可以直接通过PCR技术进行快速实验室诊断。近期大量临床报告发现，蛋鸡感染低致病性禽流感H9N2也会表现出产蛋率下降等生殖系统障碍[1]，因此，本研究也将其作为检测病原之一。

本养殖场发生疫病后，立即对病鸡进行无害化处理。经过本实验室检测后确定是ILTV感染，其gD基因与TK基因序列与疫苗毒株同源性高达99%以上，怀疑是免疫接种不及时所致。立即指导养殖人员对健康鸡群进行相应灭活疫苗的接种。经跟踪调查发现，疫苗接种后一周，发病鸡数量明显减少;2周后产蛋率逐渐恢复。

防控ILT应当采取综合防治措施：首先，要强化防疫卫生工作，人员设施严格消毒，保持饲养环境清洁;其次，加强饲养管理，减小饲养密度，重视保温、通风;最重要的是要重视免疫预防，控制ILT的最有效方法是疫苗免疫[7]。而本研究中的养殖场因之前从未发生过ILT，从育雏到成年鸡就没有免疫过ILT疫苗，最终造成该病毒有机可乘;四是一旦发生疫病，应当做好隔离、扑杀及无害化处理工作[8]。

该案例提醒养殖人员不能掉以轻心，也不能漏掉对任何疫病的免疫接种与防护。

参考文献：

[1] 秦卓明. 家禽呼吸系统疾病的综合防控[M]. 北京： 科学出版社， 2020： 190.

[2] 陈溥言. 兽医传染病学[M]. 第六版. 北京： 中国农业出版社， 2015： 377.

[3] 章红梅. 池州市鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定及gD基因序列分析[D]. 合肥： 安徽农业大学， 2016： 12.

[4] 张明伟. 鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定与PCR检测方法的建立[D]. 郑州： 河南农业大学， 2009： 18.

[5] 杨涛. 鸡肾型IBV陕西分离株的分子遗传变异分析及感染雏鸡的病理组织学观察[D]. 杨凌： 西北农林科技大学， 2013： 14.

[6] 高晓磊，朱秀同，刘思桐等. 一株鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定[J]. 今日畜牧兽医， 2019， 35（04）： 17-18.

[7] 侯占民. 1例鸡传染性喉气管炎病毒感染的诊治[J]. 养殖与饲料， 2019， 01： 102.

[8] 周汉兴，牛金鹏. 鸡传染性喉气管炎的诊断及防控[J]. 养殖与饲料， 2021， 20（07）： 104-105.

Laboratory Diagnosis and Sequence Analysis of Infectious Laryngotracheitis Virus

WANG Wenbin，FU Chunyan，YAN Peipei，SHI Tianhong，LI Xia，WEIXiangfa，

LIU Ruiting，DONG Yilei，LIU Xuelan

（Poultry Institute， Shandong Academy of Agricultural Science， Jinan  250100，China）

Abstract： A total of 8 samples of layers with respiratory symptoms and egg production disorders were collected from a chicken enterprise in Dongying city， Shandong Province. We suspected that the chickens were infected with infectious laryngotracheitis virus， infectious bronchitis virus or low pathogenic avian influenza virus via the clinical symptoms and histopathological changes. Low pathogenic avian influenza virus was excluded by virus hemagglutination test. It was identified as infectious bronchitis virus infection by PCR test. Sequencing and BLAST analysis showed that gD and TK genes had 99% homology with the vaccine strain. These results indicate that immunization against infectious bronchitis is still important.

Keywords： Infectious Laryngotracheitis; laboratory diagnosis; PCR; sequence analysis