探讨受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）在胃癌中的表达情况

刘 梅，蒋雪雪，查娟民

（苏州大学附属第一医院肿瘤科，江苏 苏州 215006）

胃癌是在我国人群中发病率和病死率均较高的消化系统恶性肿瘤，早期无症状且难以检测，诊断时已达到晚期。胃癌的发病机制目前尚未阐明，幽门螺杆菌感染、慢性炎症浸润、癌前病变、胃病史、生活习惯和饮食、精神心理因素都是与胃癌发生相关的危险因素[1]。受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1, RIPK1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调控多个信号转导，决定着细胞存活和死亡[2]。其可以通过激活NF-κB、活化Caspase-8、参与活性氧的产生等方式，调控细胞存活（survival）、细胞凋亡（apoptosis）和程序性坏死（necroptosis）等重要过程[3-4]。目前有研究[5]表明RIPK1与癌症的发生有关，但RIPK1与胃癌发生和发展之间的关系，目前尚不明确。本研究利用免疫组化初步探索了RIPK1蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入标准：术前未曾进行放化疗和靶向治疗，术后组织病理学诊断为腺癌。收集2017年6月—2021年6月我院收治的20 例胃癌患者的胃癌及癌旁组织样本，获得的标本立即存储在4%中性甲醛中。收集其他临床病理资料，包括年龄、性别、肿瘤直径、临床分期等。其中患者平均年龄为(58.8±9.1)岁；男性患者为12 例，女性患者为8例；肿瘤大小＞4.5 cm者8 例，≤4.5 cm者12 例；临床分期，Ⅰ-Ⅱ级13 例，Ⅲ-Ⅳ级7 例。

1.2 主要试剂 兔抗人RIPK1多克隆抗体购自Sigma-Aldrich公司（HPA015257），鼠抗兔二抗购自Cell Signaling Technology公司（7074），免疫组化显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司（5920）。1.3 实验方法 样本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，予以连续切片，每张切片厚约6 μm。免疫组化操作步骤如下：(1)脱蜡及水化：石蜡组织切片烘片30 min以防止组织脱片。之后使用二甲苯和乙醇进行脱蜡。(2)柠檬酸法-抗原修复及内源过氧化物的去除：柠檬酸修复液在微波炉中加热到即将沸腾，放入脱蜡水化后的玻片，继续用微波炉加热约7 min；之后自然冷却至室温。用1×PBS洗3 次，每次5 min。加入3% H2O2孵育10 min，以去除内源性过氧化物。再用1×PBS洗3 次，每次5 min。(3)一抗孵育：先用5%山羊血清封闭30 min，之后RIPK1抗体按1:200溶于1% BSA，4 ℃孵育过夜。1×PBS洗3 次，每次5 min。(4)二抗孵育：生物素标记的二抗溶于5% NGS，室温孵育60 min。1×PBS洗3次，每次5 min。(5)显色：使用即用型试剂盒（迈新5920），加入1 滴1号试剂，室温孵育30 min；然后用1×PBS洗3 次，每次5 min；再加入2 滴显色液。显微镜下观察至染色完成之后加入PBS中终止反应，随后用1×PBS洗3 次，每次5 min。(6)苏木精染色及封片：切片用苏木精染色1 min后用自来水持续冲洗，之后用乙醇和二甲苯处理并用中性树胶封片。将玻片放在通风橱内风干后，存放于玻片盒，后续显微镜观察（奥林巴斯，IX-73）。

1.4 结果判定 40倍物镜下拍摄的免疫组化照片，每张切片随机选取5 个视野，采用ImageJ的IHC Profiler插件对免疫组化进行定量，其输出结果为high positive（高阳性），positive（阳性），low positive（弱阳性），negative（阴性）的百分比，属于半定量结果[6-7]。为了进行定量比较，我们给高阳性记4 分，阳性记3 分，弱阳性记2 分，阴性记1 分，并采用下列公式进行计算：表达量得分＝(高阳性百分比×4+阳性百分比×3+弱阳性百分比×2+阴性百分比×1)/4，表达量得分介于1～4之间。

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism 8软件对实验结果进行统计分析。所有实验数据以均值±标准误表示，采用Student'st-test进行统计分析，P＜0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

免疫组化显示，无论是癌旁组织还是癌组织，RIPK1均主要分布在胞质。采用ImageJ对免疫组化染色结果进行定量分析，结果显示RIPK1在癌组织中表达量为(1.663±0.356)，在癌旁组织中表达量为(1.424±0.251)，表明和癌旁组织相比，癌组织中RIPK1的表达显著上升（P＜0.05，见表1）。在癌组织中，RIPK1的表达量与病人的性别、年龄、肿瘤大小及TNM分期均无关（P＞0.05，见表2）。

表1 胃癌组织和癌旁组织中RIPK1的表达情况

表2 RIPK1的表达与胃癌临床病理特征的关系

3 讨论

RIPK1是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，位于Tumor necrosis factor（TNF）-Tumor necrosis factor receptors（TNFRs）通路下游。RIPK1是重要的细胞信号转导分子，参与调控细胞存活、炎症、凋亡和程序性坏死等多种细胞行为[3-4]。已有的研究表明，RIPK1参与两个重要的促生存通路的激活，包括NF-κB通路和PI3K-Akt通路。这两个通路在癌症的发生、恶性增殖、侵袭、迁移等过程中发挥重要作用，提示RIPK1可能起促癌作用。

RIPK1是细胞应激过程中导致NF-κB激活的信号级联中的必要成分[8-10]。当TNF结合其受体TNFR1时，TNFR1胞内段的死亡受体结构域聚集形成三聚体，招募TRADD、RIPK1、TRAF2、cIAP1/2，形成一种质膜上的蛋白质复合物，称为复合物Ⅰ。cIAP1/2能够诱导RIPK1进行Lys63型多聚泛素化，进而募集TAK1[11-12]。随后，TAK1磷酸化由IKKβ、IKKα、IKKγ形成的IKK复合物，活化的IKK复合物磷酸化下游抑制蛋白IκBα，促进IκBα蛋白降解，从而释放NF-κB二聚体。NF-κB二聚体易位至细胞核，结合到染色质上，最终激活下游靶基因转录[8-10]。RIPK1使用双重机制激活PI3K-Akt。一方面，RIPK1表达的增加通过阻断mTOR负反馈环，从而激活PI3K-Akt。另一方面，RIPK1能够下调胞内PTEN的表达水平，且这一过程不依赖于NF-κB的激活[13]。

目前，越来越多的证据提示RIPK1在癌症的发生发展中起了重要作用。已有研究[14-15]表明，RIPK1在胰腺癌、恶性胶质瘤等多种癌组织中表达上调。体外研究[16-17]表明，在结肠癌细胞系中过表达RIPK1能促进细胞增殖，RIPK1也可通过NF-κB信号调控非小细胞肺癌细胞增殖[18]。采用干扰siRNA特异性沉默RIPK1的表达后，细胞的体外增殖能力明显降低，并诱导了细胞凋亡的发生[19]。癌症是一系列原癌基因激活或抑癌基因失活而引起。P53抑癌基因的失活是许多癌症发生的重要原因。Park等[15]在恶性胶质瘤中发现，RIPK1可以负性调节P53肿瘤抑制性信号，RIPK1表达水平的增高可以完全抑制DNA损伤诱导的P53的增加，这种作用是通过上调胞内mdm2的水平实现的。因此，RIPK1通过激活NF-κB来上调mdm2，从而抑制P53。

本研究中，胃癌组织RIPK1主要定位于肿瘤细胞的细胞质，患者癌组织中RIPK1的表达明显高于对应癌旁组织，提示RIPK1表达增高是胃癌发生发展的一个重要因素。RIPK1参与胃癌发生发展的分子机制还需要进一步研究。