牛胚胎冷冻技术及冷冻保护剂研究进展

2022-03-16翟亚莹张子敬吕世杰朱肖亭张格阳朱进华李峥于翔王红利施巧婷闫祥洲王二耀

中国畜禽种业 2022年10期

翟亚莹张子敬吕世杰朱肖亭张格阳朱进华李峥于翔王红利施巧婷闫祥洲王二耀*

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州 450002；3.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450008；4.河南省动物检疫总站，河南郑州 450000；5.河南省郏县红牛产业发展中心，河南平顶山 467100）

胚胎冷冻保存是胚胎移植过程中重要的步骤之一，在地方牛品种遗传资源保护方面具有广泛的应用价值，最早可以追溯到20 世纪50 年代初期，Smith用甘油作为冷冻剂冷冻了600 枚兔的胚胎，解冻培养只有6 枚发育。1972 年，Whittingham[1]首次将小鼠胚胎置于超低温（-196℃）的液氮中，液氮中的细胞代谢速率下降，胚胎能长期稳定保存，复苏后小鼠胚胎仍能够存活，开启了胚胎冷冻技术的先河。胚胎冷冻技术将胚胎稳定地存于液氮中，将体外胚胎进行跨时间、区域运输，克服了地区和时间的限制，使这些胚胎广泛用于胚胎移植行业。近年来，最广泛应用的是快速冷冻法和玻璃化冷冻法，该文将从胚胎冷冻技术发展历程、冷冻保护剂等方面展开综述。

1 胚胎冷冻技术

胚胎冷冻技术就是将动物的早期胚胎置于冷冻保护液中，通过降温措施，将胚胎稳定存放在液氮中，使胚胎的生命活动减弱或暂时中止，但复温后可以迅速恢复生长的能力，以达到长期体外保存胚胎的目的。胚胎的冷冻液可以用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）配制，pH 保持7.2～7.4，也可用TCM-199 或生理盐水来配制[2]。冷冻胚胎过程中温度降至-15～-50℃时，大的冰晶易在细胞内形成，冰晶的形成对于细胞来说是致命的，很可能导致细胞的死亡[3]。随着人们对胚胎冷冻技术的探索，人们不断克服常规冷冻方法存在的缺点，尝试通过改变冷冻方法、添加冷冻保护剂等方式提高胚胎冷冻的效率。胚胎冷冻的方式主要有三种：慢速冷冻法，快速冷冻法，玻璃化冷冻法，目前玻璃化冷冻法广泛应用于生产实践。胚胎冷冻技术对于保护良种牛，发展优秀种质资源有着重大意义。

1.1 慢速冷冻法

乙二醇（EG）、甘油（GLY）、二甲基亚砜（DMSO）等常被作为慢速冷冻法的冷冻保护剂。胚胎被浸泡在浓度由低到高的冷冻保护剂中，分三步或四步使其完全进入胚胎，然后用冷冻装置缓慢冷却，降温速度低于1℃/min，当温度达到-30～-80℃时，将胚胎放置于在液氮中[4]。1973 年慢速冷冻法首次用于冷冻牛胚胎，解冻后经胚胎移植成功生出小牛[5]。

慢速冷冻法的缺陷体现在以下几个方面：第一，胞内水过冷状态不稳定，会形成胞内冰晶，使胚胎的存活率和着床率较低。第二，慢速冷冻需要控制冷冻速率，以减少冰晶形成对胚胎造成的伤害，因此，冷冻过程需要较长的时间。第三，慢速冷冻法会使胚胎过度脱水，必须采用慢速解冻法，缓慢复苏胚胎，提高胚胎成活率。慢速冷冻法对胚胎伤害较大，冷冻过程烦琐，解冻过程复杂，这些因素限制了慢速冷冻技术的广泛应用。

1.2 快速冷冻法

快速冷冻法由慢速冷冻法改进而来，不需要使用梯度冷冻，而是直接将胚胎投入液氮中。快速冷冻法优点是耗时短，冷冻液作用时间短，对胚胎毒性小，缺点是降温速度快，冰晶形成多[6]。

快速冷冻法经常使用两种或两种以上物质作为冷冻保护剂。甘油和蔗糖（sucrose）首次作为胚胎冷冻剂冷冻小鼠胚胎，解冻复苏后囊胚率达到61%～65%[7]。Chupin 将2.8mol/L 甘油和0.25mol/L 蔗糖作保护剂冷冻牛胚胎，将牛胚胎直接投入液氮冷冻，解冻复苏后胚胎囊胚率为50%。科研人员对该方法进一步改进，将牛胚胎置于液氮瓶颈处预冷5min，再将胚胎投入液氮，解冻后胚胎的囊胚率可达67.6%。为了进一步简化胚胎解冻过程，国内研究人员将1 份保护剂和3 份稀释剂直接装入冷冻胚胎的细管中。解冻后，轻敲管子，使溶液在管内混合，冷冻保护剂被高度稀释，可以实现将胚胎直接移植，简化了胚胎解冻的烦琐过程[8,9]。

1.3 玻璃化冷冻

玻璃化冷冻是1985 年兴起的一种胚胎冷冻方法。该方法通过添加高浓度的冷冻剂使胚胎快速脱水，在0℃以下投入液氮中对胚胎进行冷冻保存，操作简单，不需要昂贵的仪器设备。玻璃化法高浓度的冷冻剂在低温下呈现黏稠态，达到临界值时液体发生固化，形成了没有结构的玻璃态，从而避免冰晶的形成，减少冰晶对于细胞的损害[10]。另外，牛胚胎在慢速冷冻法中具有冷敏感性，该方法可以避免这种冷敏感，使得存活率比慢速冷冻法的存活率更高[11]。玻璃化冷冻的缺点主要体现在高浓度冷冻剂的毒性作用，因此需要严格控制冷冻剂的作用时间。虽然玻璃化冷冻还存在缺陷，但科研工作者们在不断探索改进，相信该方法将有很大提升和广阔的应用前景。

1.3.1 两步法

最初Kasai 进行玻璃化冷冻的探索，以25%甘油和25%丙二醇（PG）为冷冻液，将小鼠8 细胞进行玻璃化冷冻，取得了不错的效果。但此配方应用于牛胚胎体外培养时，牛胚胎到桑椹胚便停止发育。随着科技的进步，科研人员改进了冷冻液配方，两步法中的冷冻液由40%乙二醇、18%聚蔗糖（ficoll）以及0.26%蔗糖（sucrose）在TCM-199 中组成。冷冻步骤分两步进行：冻存前，胚胎在0.8mL 的20%乙二醇液中存放3min，继而转移至0..8mL 的玻璃化冷冻液中短暂停留，随后装入0.25mL 冻精细管，在30～45s内投入液氮罐中保存[12]。通过两步法冻存的牛胚胎可以更好地发育，冻存液对于胚胎的各个发育时期均具有保护作用。丁家桐通过该方法冻存山羊胚胎，解冻移植后的妊娠率达到61.5%，产羔率达到40%[13]。朱世恩通过两步法冻存兔囊胚胚胎，解冻后发育率达到90%，妊娠率达到29.2%[14]。

1.3.2 开放式细管法（OPS 法）

OPS 冷冻法是使用OPS 薄壁吸管，加热后将其拉至管的一半直径和厚度，利用毛细管现象将极少量的冷冻液与胚胎一起吸至OPS 管的末端，最后将OPS管直接放入液氮中进行冷冻保存[14]。OPS 法操作便捷，不要冷冻仪器，极少的冷冻液可达到迅速冷冻、快速解冻以及快速去除保护剂的目的。由于管中冷冻液量很少，还减少了对胚胎的毒害作用。此方法近年来已经广泛用于牛胚胎的冷冻保存。

1.3.3 Cryotop 冷冻法

Cryotop 法与OPS 法有类似之处，将含有胚胎的玻璃化液滴（约0.1μL）放置在细聚丙烯条内，然后立即垂直放入液氮中完成冷冻，冷冻后用塑料帽盖住Cryotop 板，存放在液氮中[15]。该方法使用的冷冻液体积更小，冷冻和解冻速率更高。用Cryotop 法冷冻保存牛胚胎可以使囊胚孵化率达到90%，Cryotop 法简单便捷，是一种实用的玻璃化冷冻技术[16]。

2 冷冻保护剂

冷冻保护剂是为了减少或防止细胞在冷冻过程中受到损伤的试剂，目前常分为细胞内液冷冻保护剂、细胞外液冷冻保护剂和抗冻蛋白等。在慢速冷冻法中，只有一种物质被用作冷冻保护剂，如甘油、乙二醇、DMSO，而在快速冷冻法和玻璃化冷冻法中，通常是几种冷冻保护剂同时使用。

2.1 细胞内液冷冻保护剂

细胞内液冷冻保护剂通常是分子量小且具有穿透细胞膜能力的物质，如乙二醇，甲醇（MT），丙二醇、甘油、二甲基亚砜等。Rall 和Fahy 用20.5%DMSO、15.5%乙酰胺、10%丙二醇、6%聚乙二醇作为玻璃化冷冻液，冷冻小鼠胚胎，获得了87.7%的冷冻成活率[17]。许文兵的研究指出，以EG 为冷冻保护剂，固体表面载杆为冷冻载体，冷冻转基因牛的早期囊胚可以获得最佳效果[18]。

2.2 细胞外液冷冻保护剂

细胞外液冷冻保护剂常为大分子、非渗透性细胞膜物质，例如蔗糖、海藻糖（trehalose）、半乳糖（galactose）、聚蔗糖、海藻糖（trehalose）等。蔗糖因其在低温下对细胞没有毒害作用，而被作为玻璃化冷冻保护液的主要成分广泛应用[19]。2004 年，Gong 等采用OPS 法玻璃化，以40%乙二醇+30%聚蔗糖+0.5mol/L 蔗糖为冷冻保护剂，冷冻牛的SCNT 囊胚，第60d 妊娠率和产犊率均为33.3%[20]。Zhao 等用15%乙二醇+15%DMSO+0.3mol/L 蔗糖为冷冻保护剂，使用OPS 冷冻法玻璃化冷冻牛ICSI 胚胎，解冻后存活率为82.4%[21]。近年来的研究表明，乙二醇、蔗糖、聚蔗糖作为冷冻保护剂配置成的EFS40 是比较理想的冷冻保护液。

2.3 抗冻蛋白

抗冻蛋白（AFPs）是一类能附着在冰晶表面，与冰晶结合后可以遏制其生长的蛋白质，由Devriesde等在海冰地区鱼类血液中鉴定出来[22]。后来科研人员不但在多种鱼类中鉴定出该物质，在植物和昆虫体内也有发现。AFPs 具有稳定细胞膜的作用，与冰晶结合后可以阻止冰晶生长，在冷冻液中再结晶，减少细胞损伤。该物质应用于牛胚胎冷冻可以减少冰晶对胚胎的伤害，对保持胚胎完整性具有重要意义。