基于多元统计分析方法的人字果药材中木兰花碱的含量与环境因子的关联性分析*

员 浬，柏彩红，徐文芬，王 波，陆 祥，孙庆文

(贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025)

人字果系毛茛科(Ranunculaceae)人字果属(Dichocarpum)植物蕨叶人字果Dichocarpumdalzielii(J.R.Drummond & Hutchinson) W.T.Wang & P.K.Hsiao的干燥全草。具有清热解毒、消肿止痛等功效，常用于跌打肿痛、无名肿毒等病症[1]。其原植物分布于四川、贵州、广西、广东、江西等地[2]。现为《贵州省中药材、民族药材质量标准》修订研究新增补品种。但目前针对蕨叶人字果除分类学研究[3-8]外，涉及其化学成分及药理作用研究几乎处于空白。人字果药材主要依赖于野生资源，野外藏量中等，贵州民间常代替黄连入药，但不同产地其药材质量参差不齐，十分不利于药材的合理应用及质量控制。加之其分布范围较广，其主产地(黔、桂)由于特殊喀斯特地貌形成了许多环境特异的小生境，而环境因子在药用植物的生长及品质形成过程中又起着决定性作用。故此，确定环境因子对人字果药材化学成分的影响对于揭示人字果药材品质形成机制显得十分重要。

药用植物往往分布在不同地区，在不同地区异质生境下药用植物获得温光水汽热的机会通常差异较大，药用植物通过适应于不同环境下功能性状的可塑性促进了植物性状的分化，导致不同产地药材产量和质量存在差异。在药材质量评价中有效成分含量的高低是其中最重要的指标，课题组前期研究表明木兰花碱为人字果药材的主要成分，且其具有良好的抗心律失常、抗炎、抗抑郁、降压等作用[9-15]。因此，本文采用HPLC法与多元统计分析方法相结合，以木兰花碱的含量为指标，对不同产地人字果药材内在成分与环境因子的相关性进行分析，为药材的资源合理开发利用及提高药材质量提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo UltiMate-3000型高效液相色谱仪，DAD检测器(美国赛默飞公司)；Pntulips BP-C18柱(上海谱宁分析技术有限公司)；AG135型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)等。

1.2 材料

乙腈、甲醇(均为美国天地有限公司，色谱纯)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)；三乙胺(天津市瑞金特化学品有限公司，分析纯)；甲醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；木兰花碱对照品(购于成都曼思特生物科技有限公司，批号为MUST-17071711，纯度为99.02%)。

供试样品采于贵州省各主要分布区，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为毛茛科植物蕨叶人字果Dichocarpumdalzielii(J.R.Drummond & Hutchinson) W.T.Wang & P.K.Hsiao，所有样品经40 ℃烘干，粉碎过三号筛，置干燥器中备用。人字果药材样品采集信息详见表1。

表1 人字果药材采集信息Tab.1 The collection information of Dichocarpum dalzielii

2 方法与结果

2.1 环境因子查询

人字果不同产地气候因子数据(精度1 km)，从全球气候数据库World Clim(http：//www.worldclim.org/)下载，利用ArcGIS软件对各采集点气候数据进行提取，结果见表2。

表2 本实验所用的20个环境因子Tab.2 The 20 environmental factors investigated in the test

2.2 木兰花碱含量测定[16]

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Pntulips BP-C18柱(250×4.6 mm，2.5 μm)；流动相：乙腈(A)与0.1%磷酸-0.1%三乙胺(B)，梯度洗脱(0～10 min，5%～20%A，95%～80%B；10～30 min，20%～40%A，80%～60%B)；流速：1 mL·min-1；检测波长：270 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取木兰花碱对照品适量，置容量瓶中，加75%甲醇溶液制成浓度为0.4003 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末约1.0 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液25 mL，称定重量，超声提取(功率100 W，频率40 Hz)45 min，取出，放冷，用75%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取15 mL续滤液，用25 mL石油醚(30～60 ℃)萃取3～4次，至上层颜色无明显变化后，得下层萃取液，即为供试品溶液。

2.2.4 专属性考察试验

为考察供试品溶液的提取溶剂和流动相的干扰情况，精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液及空白溶液，按上述色谱条件进行测定，如图1所示，空白溶液在相应位置处未见色谱峰，供试品溶液色谱中待测目标峰与木兰花碱对照品色谱峰保留时间和UV光谱图一致，分离度大于1.5且达到基线分离，峰纯度分别为999.96和999.99。表明该方法专属性良好。

图1 人字果专属性试验的HPLC色谱叠加图Fig.1 The HPLC overlapping chromatogram of the specificitytest of Dichocarpum dalzielii

2.2.5 线性关系考察

分别精密吸取上述木兰花碱对照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，置5 mL容量瓶中，加入75%甲醇溶液至刻度，摇匀，配制成系列浓度对照品溶液，依法分别注入高效液相色谱仪测定。以对照品进样量为横坐标X，峰面积值为纵坐标Y，计算回归方程和相关系数，得：Y=21.796X-0.6441，r=0.9999。结果表明木兰花碱进样量在0.2002～10.01 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验

精密吸取0.4003 mg·mL-1木兰花碱对照品溶液，连续进样6次，依法测定，记录木兰花碱色谱峰的峰面积，计算峰面积的RSD值为0.47%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验

取人字果药材(GXG002)粉末约1.0 g，精密称定，共6份，分别制备供试品溶液，依法分别进样测定，计算木兰花碱的平均含量为4.54 mg/g，RSD值为1.1%，表明该法测定的重复性良好。

2.2.8 稳定性试验

人字果药材(GXG002)粉末约1.0 g，精密称定，制备1份供试品溶液，按照上述色谱条件，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h分别进样测定，记录木兰花碱色谱峰的峰面积，计算其峰面积的RSD为0.60%，结果表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.2.9 加样回收试验

取人字果药材(GXG002)粉末9份，每份约0.5 g，精密称定，分别按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入木兰花碱对照品，按 “2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件，分别进样测定，并记录木兰花碱色谱峰的峰面积，计算木兰花碱的平均回收率为100.66%，RSD值为2.6%，表明该法测定结果的准确度高。结果见表3。

表3 加样回收率试验结果(n=9)Tab.3 Results of the spiked recovery tests(n=9)

2.2.10 样品测定

分别取23批人字果药材粉末，按 “2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件，分别进样测定，并记录木兰花碱色谱峰的峰面积，以标准曲线法计算干品药材中木兰花碱的含量，结果见表4。

表4 23批人字果药材干品中木兰花碱测定结果(n=3)Tab.4 Determination results of magnoflorine in 23batches of Dichocarpum dalzielii(n=3)

由表4可知，23批干品人字果药材中木兰花碱含量在0.16%～1.49%之间，其中贵州独山甲定乡产药材中(JDX001)木兰花碱含量最高，为1.49%，贵州绥阳观音岩产药材中(GYY002)含量最低，为0.16%。

2.3 木兰花碱含量与环境因子相关性分析

2.3.1 双变量关联分析结果(BCA)

采用SPSS 26软件对木兰花碱含量及19个环境因子提取值进行数据分析，选择Pearson相关系数进行双侧检验分析，所得结果：Altitude、Bio2(平均气温月较差)、Bio3(等温性)、Bio13(最湿月降水量)、Bio16(最干季降水量)、Bio17(最湿季降水量)、Bio18(最热季降水量)、Bio19(最冷季降水量)与木兰花碱含量呈正相关，Bio4、Bio7呈负相关，而与Bio1(年平均气温)、Bio5(最热月的最高气温)、Bio6(最冷月的最低气温)、Bio8(最湿季平均气温)、Bio10(最热季平均气温)、Bio12(年降水量)、Bio14(最干月降水量)、Bio15(降水量的季节性变化)无显著性关系(P<0.05)，无统计学意义。因此，筛选出对木兰花碱含量影响具有统计学意义的环境因子12个，见表5。其中木兰花碱含量与环境因子的Pearson相关系数排列顺序为：Bio18>Bio16>Bio3>Bio4>Bio2>Bio7>Bio13>Altitude>Bio17=Bio19>Bio9=Bio11。

表5 23批人字果药材不同产地的环境因子提取值Tab.5 The extracted values of environmental factors of the 23batches of Dichocarpum dalzielii from different producing areas

2.3.2 灰色关联度分析(GRA)

BCA所得结果显示，其中8个环境因子与木兰花碱含量无显著相关性，无统计学意义。因此，将筛选出的12个与木兰花碱含量呈显著相关的环境因子所得值导入灰色关联度软件，选择邓氏灰色关联度，得到每个因子的相关系数，见表6。结果显示，12个环境因子与木兰花碱含量关联度均大于0.7，表示12个环境因子对木兰花碱均具有较强的关联性。其中12个环境因子与木兰花碱含量的邓氏灰色关联度排列顺序为：Altitude>Bio17>Bio19>Bio13>Bio16>Bio18>Bio3>Bio2> Bio7>Bio4>Bio9=Bio11。

2.3.3 主成分回归分析(PCR)

由于12组环境因子之间存在严重共线性，因此选择主成分回归分析以解决数据之间存在的此类问题。将“2.3.1”项下筛选出的12个环境因子进行因子分析，以12个环境因子提取值为自变量X，以木兰花碱含量为因变量Y，其建立的函数关系如下：

Y=-7.1744+0.0681X1+0.2381X2-0.0694X3-0.0570X4+0.0444X5+0.0444X6-0.0815X7-0.2350X8-0.0686X9+0.0049X10-0.0686X11+0.0503X12

其中，X1～12表示表5中的12个与木兰花碱含量呈显著相关的环境因子。

其标准化系数见表6，结果显示，Altitude、Bio1、Bio2、Bio3、Bio9、Bio11、Bio18显示正相关；Bio4、Bio7、Bio13、Bio16、Bio17、Bio19显示负相关。其中，标准化系数排列顺序为：Bio3>Bio16>Bio2>Bio18>Bio13>Bio4>Bio17 = Bio19>Bio7>haiba>Bio9=Bio11。

表6 多元统计分析对不同环境因子与木兰花碱含量关系的相关系数Tab.6 Correlation coefficients between different environmentalfactors and magnoflorine content by multivariate statistical analysis

2.3.4 偏最小二乘回归分析-变量重要性投影(PLS-VIP)

将“2.3.1”筛选出的12个与木兰花碱含量呈显著相关的环境因子所得值导入SIMCA 14.1软件，建立PLS数理模型，得到其标准化系数见表6。结果显示，木兰花碱含量与Bio4、Bio7呈负相关，与其余9个环境因子呈正相关，其标准回归系数大小排序为：Bio18>Bio16>Bio3>Bio4>Bio2>Bio7>Bio13>Altitude>Bio17=Bio19。选择12个环境因子提取值为自变量X，23批人字果药材中木兰花碱含量为因变量Y，其函数关系如下：

Y=-0.7624+0.01148X1+0.02064X2-0.00013X3-0.00520X4+0.00190X7+0.00010X8+0.00154X9+0.00165X10+0.00155X11-0.00006X12

以VIP值为依据，其得分总贡献率为Bio18>Bio16>Bio3>Bio4>Bio2>Bio13>Altitude>Bio17=Bio19。除Bio9、Bio11变量显著线超过矩阵外，其余均未超出矩阵，具统计学意义，见图2。

图2 木兰花碱的VIP得分矩阵图Fig.2 VIP score matrix diagram of magnoflorine

为综合评价木兰花碱含量与环境因子的影响关系，以BCA、GRA、PCR、PLSR为组别，导入Graphpad prism 8.0 软件建立堆积柱状图，用以表征每个环境因子对木兰花碱含量的影响情况，见图3。结果表明，人字果药材中木兰花碱含量与Bio2、Bio3、Bio18、Altitude显示显著的正相关；与Bio13、Bio16、Bio19显示较为显著的正相关；与Bio4、Bio7显示较强的负相关。

图3 木兰花碱含量与12个环境因子相关性堆积柱状图Fig.3 Stacked histogram of the correlation between magnoflorinecontent and 12 environmental factors

2.4 人字果相关指标空间含量估计

以对木兰花碱影响较大的等温性、最热季降水量以及海拔为解释变量，采用协同克里金方法进行空间插值计算，结果显示，在采样范围内木兰花碱的含量由南部至北部呈逐步降低趋势。其中，贵州省独山地区含量最高，见图4。

图4 木兰花碱的空间插值结果Fig.4 Spatial interpolation results of magnoflorine

3 讨论

本实验采用DAD检测器3D图谱对检测波长进行了筛选，结果表明，木兰花碱在270 nm处有最大吸收，且分离度较好。采用甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%磷酸-0.2%三乙胺，乙腈-0.2%磷酸-0.2%二乙胺等进行梯度洗脱，目标峰与其他杂质峰分离效果均不理想，经过进一步优化，确定乙腈-0.1%磷酸-0.1%三乙胺作为流动相。分别对Thermo Accucore-C18(150×4.6 mm，2.6 μm)、依利特Hypersil ODS(250×4.6 mm，5 μm)、Agilent StableBond Analytical(250×4.6 mm，5 μm)、Pntulips BP-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)4种色谱柱的分离效果进行分析比较，结果表明，Pntulips BP-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)的峰形，分离度均较好，故选之。检测柱温为25 ℃时分离效果较好。

人字果药材木兰花碱含量测定结果表明同一时期采集的贵州绥阳和独山产药材中木兰花碱含量相差近4倍，表明不同产地对人字果药材中木兰花碱的含量影响较大，环境因子可能对其成分累积具有重要影响作用。因此，本实验进一步提取出不同产地的环境因子并结合多元统计分析方法对23批人字果药材的木兰花碱含量与环境因子进行关联分析，对其影响情况及相关性进行初步研究。如图3结果显示，木兰花碱含量与等温性(Bio3)、最热季降水量(Bio18)、海拔(Altitude)显示显著正相关，即较高的等温性，充沛的水分，较高的海拔，较高的日照环境对人字果药材次生代谢产物木兰花碱的含量具有正向累积作用；与气温季节性变动系数(Bio4)、气温年较差(Bio7)显示较强的负相关，即较小气温季节性变动系数及气温年较差对木兰花碱的含量具有正向累积作用，而Bio3、Bio4、Bio7这3个气候因子均与温度有关，可初步说明温度可能是影响人字果药材内木兰花碱含量的决定性因子。其次，降水量也与木兰花碱含量呈较强相关性，侧面反映了水分条件对于人字果药材内次生代谢产物木兰花碱的累积具有重要影响，较高的降水量有利于人字果药材中木兰花碱成分的累积。另外，气温季节性变动系数、气温年较差均与木兰花碱的含量呈较强负相关，可见，人字果药材中木兰花碱的含量对气温季节性变化的响应较为明显，且初步推测气温变化较大的区域不适合人字果药材中木兰花碱成分的累积。综上，较高的等温性、充沛的水分、较高的海拔及较小的气温季节性变化对人字果药材中次生代谢产物木兰花碱的累积具有积极意义。此外，从空间插值结果来看，木兰花碱含量在贵州省独山地区显示最高。

本文结合多元统计方法对人字果中木兰花碱含量与环境因子的相关性分析，初步揭示了影响人字果药材中木兰花碱成分累积的主导环境因子，为人字果药材的质量控制及其野生变家种研究提供理论依据。